柯因的肝保護效果及其作用機制研究進展

何燕 徐夢婷 季超 季劍 季福標 葉滿紅 周斌

（1 揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009；2 揚州大學生物科學與技術學院，揚州 225009；3 江蘇日高蜂產品有限公司，淮安 211700）

肝臟疾病，包括（非）酒精性脂肪肝、肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝癌等，在全世界范圍內都具有相當高的發病率和死亡率，嚴重威脅人類健康。臨床上有多種藥物針對不同的肝損傷形式進行針對性治療，然而鑒于化學藥物不可避免的副作用，各具其局限性，因此，越來越多的研究者致力于從天然產物粗提物或純化產物中尋找并開發可用于肝臟疾病的、與藥物治療互補甚至是替代的物質。

柯因（5,7-二羥黃酮），英文chrysin，別名白楊素，是廣泛存在于蜂蜜、蜂膠以及多種植物提取物中的一個黃酮類物質。在以楊樹為主要膠源植物的中國蜂膠中，柯因的含量較高，是中國蜂膠中黃酮類物質的一個典型組分[1]。研究表明：柯因具有廣泛的生物學活性，如抗炎癥[2]、抗腫瘤[3]、抗過敏、抗氧化[4]、免疫調節等[5]，對多種器官如肝臟[6]、腎臟[7]、結腸[8]具有保護效應，對慢性疾病如糖尿病[9,10]、心血管疾病[11]也有一定的正面作用。尤其是在多種肝臟疾病中，如化學毒物、高脂日糧和抗腫瘤藥物所誘發的一系列肝臟損傷中，柯因都表現出顯著的肝保護效果，體內和體外的實驗結果還表明：柯因對肝臟腫瘤也有一定的抑制作用。由于柯因在多種植物來源的提取物中都具有較高含量，可作為安全的膳食補充劑和草藥制劑使用，因此在保健、預防和治療肝臟疾病上具有廣泛的應用前景。

1 柯因在化學毒性物質誘發的肝臟損傷中的保護作用

目前，全世界范圍內有數百萬人遭受由化學物質所導致的肝臟損傷，如四氯化碳、D-半乳糖胺（D-GalN）、四氯二苯并-p-二惡英（TCDD）、對乙酰氨基酚、亞硝胺和多環芳烴等，這些化學物均能對肝臟產生顯著的破壞作用。

1.1 四氯化碳（CCl4）

肝臟是機體代謝多種有害異物的首要器官。CCl4（一種工業溶劑、清潔劑和脫脂劑）可導致肝臟一系列進行性的病理變化，從引發炎癥開始，到肝臟壞死、肝纖維化，直至肝硬化[12]，目前被廣泛用于誘導外源性毒物引起的肝臟損傷模型。

1.1.1 柯因調節機體抗氧化水平——緩解氧化應激

肝臟中，在細胞色素P450 2E1的作用下，CCl4迅速轉化為高反應性的三氯甲基自由基，CCl4的直接毒性作用被認為是由于其誘導產生的自由基而引發氧化應激、導致脂質過氧化，從而使肝臟功能受損[13]。在雄性SD大鼠上通過腹腔注射CCl4可誘導肝損傷，研究表明[14]：富含柯因的姜科植物益智的乙醇提取物及二氯甲烷提取物具有同西利馬林（公認的具有肝保護作用的黃酮）相似的肝保護效應，能夠顯著降低血清中天門冬氨酸轉氨酶（AST）、丙氨酸轉氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）以及總膽紅素的水平。在這種肝保護作用中，清除自由基、抑制活性氧（ROS）的產生和脂質過氧化、增加抗氧化活性，對于緩解CCl4所誘導的氧化應激起著重要的作用。進一步的研究發現，在此過程中Nrf2（nuclear factor E2-related factor 2）路徑的激活至關重要。轉錄因子Nrf2能夠誘導對ROS和毒物發揮解毒活性的相關酶基因的表達[15]，從而保護組織免受ROS和毒物的損傷。富含柯因的提取物通過提高肝組織中Nrf2相關蛋白的表達，從而提高機體的抗氧化水平。

1.1.2 柯因抑制炎癥——減少促炎癥細胞因子的釋放

在CCl4的作用機理上，已有的研究表明：急性的炎癥使活化的枯否氏細胞（即肝巨噬細胞）釋放細胞因子，而這正是肝臟損傷的一個關鍵事件。CCl4在肝臟中所產生的氧化應激，會促使多種促炎癥因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、環氧酶2（COX-2）和白介素6（IL-6）的釋放[16]，從而發動炎癥反應，且伴有細胞凋亡的增加[17]。在這一過程中，TNF-α是枯否氏細胞合成的一個主要的促炎癥蛋白[18]，由其引發了介導炎癥反應的、細胞因子的級聯放大過程。

Hermenean等[19]在雄性CD-1小鼠上的研究表明：在腹腔注射CCl4誘導急性肝損傷之前，對小鼠進行為期1周的柯因灌胃預處理（50 mg/kg），在血清學指標上可以降低其中反映肝功能的兩個指標AST和ALT的水平；在組織學上，可顯著改善CCl4所引起的小葉中心壞死、脂肪變性以及肝細胞亞顯微結構異常；同時，柯因預處理還導致肝臟中促炎癥細胞因子TNF-α和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達顯著下降，其效果與同劑量的西利馬林的作用相當。進一步的研究發現，柯因主要是通過與TNF-α轉化酶（TACE，一種鋅內肽酶）形成復合物從而調節TNF-α前體的加工、減少可溶性TNF-α的釋放，從而緩解炎癥。

1.1.3 柯因抑制肝纖維化——抑制肝星狀細胞的活化及細胞因子的產生

CCl4導致的慢性肝臟損傷還可繼續演變為肝纖維化。在此過程中，肝星狀細胞（HSCs）的活化與肝纖維化的發生有著緊密聯系。肝損傷時，HSCs活化，隨后釋放細胞因子和趨化因子，由此誘導了其向肌成纖維細胞樣細胞的分化轉化。這一過程是以α-SMA以及原膠原-1的出現為特征的，最終導致了細胞外基質（ECM）組分以及膠原的產生及累積，從而導致肝纖維化[20]。在肝纖維化的病理發生過程中，轉化生長因子TGF-β——肝臟中主要的致纖維因子（細胞因子的一種），被認為是HSCs的關鍵激活因素。TGF-β同時直接或間接作用于不同類型的肝細胞，一方面TGF-β作用于HSCs使其向肌成纖維細胞分化，并且產生ECM；另一方面，肝細胞也對TGF-β做出響應，導致肝細胞的凋亡，并且對肝細胞的再生過程進行控制。在HSCs中，TGF-β通過活化Smad信號途徑而起作用[21]。TGF-β可促進Smads2和Smads3這兩個蛋白的表達，激活HSCs中膠原的轉錄合成，上調ECM相關蛋白的合成等[22]。

Balta等[23]在雄性CD1小鼠上的研究發現，柯因對CCl4所造成的慢性肝損傷具有顯著保護作用。柯因處理（50～200 mg/kg）可以顯著降低肝纖維化的程度，減少因CCl4激活HSCs所誘導的α-SMA的表達，顯著下調細胞因子TGF-β的水平；同時，肝臟中Smad2、Smad3 mRNA的表達水平顯著下降，從而逆轉由CCl4所誘導的肝纖維化，其效果與相同劑量（200 mg/kg）的肝保護黃酮西利馬林的效果相當；說明柯因的肝保護機制主要是通過TGF-β/Smad 途徑抑制HSCs的活化及其增殖。

肝臟纖維化的過程是可逆的，而肝硬化——肝纖維化發展的最終階段通常是不可逆的。柯因作為一種能有效地抗纖維變性的天然黃酮，可以阻止、減緩或者逆轉肝纖維化的進程，因此，在肝纖維化的治療上具有潛在的應用前景。

1.2 D-半乳糖胺（D-GalN）

D-GalN所誘導肝損傷，與臨床上病毒性肝炎的肝臟病理變化非常類似，其與脂多糖組合被經常用于產生與病毒、藥物或酒精誘導、免疫誘導、劑量缺血再灌注肝炎有關的亞致死性肝功能衰竭[24]。一開始認為：D-GalN進入體內后，在肝細胞中高濃度的半乳糖激酶以及 UDP-葡萄糖：半乳糖-1-尿苷酰轉移酶的作用下，體內生成大量的UDP-D-GalN衍生物，導致尿苷磷酸酯庫的耗竭，從而抑制依賴于尿苷酸核苷酸的生物合成過程，抑制mRNA和蛋白質合成[25]，進而導致細胞膜通透性的改變以及之后細胞內酶的滲漏。后續的研究逐漸發現ROS在D-GalN所誘導的肝損傷中也有重要作用[26]。

1.2.1 柯因具有抗高血脂作用——優化血清指標

Pushpavalli等[27]在雄性白化Wistar大鼠上通過腹腔注射D-GalN誘導肝臟損傷，同時對大鼠進行灌胃柯因處理（25 mg/kg），其結果表明：柯因處理可使反映肝功能的多個指標如AST、ALT、ALP以及γ-谷氨酰轉肽酶（γ-GT）均有所下降，同時還降低血漿中的總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、游離脂肪酸的水平，降低極低密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的水平，而增加高密度脂蛋白膽固醇，優化多項血清指標，表現出顯著的肝保護效應及抗高血脂活性，且其保護效應與保肝藥西利馬林相當。

1.2.2 柯因具有抗氧化作用

針對D-GalN所誘導肝損傷，Pushpavalli等[28]在雄性白化Wistar大鼠上對其進行20 mg/kg體重的柯因灌胃處理，結果顯示：柯因可以顯著降低大鼠肝功能標志酶的活性，降低脂質過氧化產物如減少與硫代巴比妥酸反應的物質（TBARS）、脂質過氧化氫和共軛二烯的產生；增加了自由基清除酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的活性，同時也增加了非酶抗氧化類物質如還原型谷胱甘肽、Vc、VE的含量；說明柯因可通過提高機體的抗氧化水平對D-GalN所誘導的肝損傷發揮其肝保護功能。

1.3 四氯二苯并-p-二惡英（TCDD）

TCDD是廣泛存在于環境（如除草劑）中的一種污染物，可作用于人和實驗動物，導致包括消耗綜合征、肝臟毒性、免疫毒性、致畸、致突變以及致癌等一系列的毒性效應。其中，氧化應激是TCDD作用機制的一個重要部分。TCDD對肝臟的損害主要表現為：使丙二醛（MAD）水平上升促進脂質過氧化，降低谷胱甘肽的含量，降低抗氧化相關酶類CAT、GPx和SOD的水平，降低肝細胞膜的流動性。在組織學上表現出嚴重的損傷，如肝細胞體積顯著增大、肝細胞中含有空泡、出現很多凋亡的肝細胞（與caspase-3反應呈陽性的細胞）等[29]。

Ciftci等研究表明[30]：TCDD在雄性白化Wistar大鼠上所誘導的肝組織形態的異常變化以及肝臟抗氧化酶活力的改變，可以通過柯因和槲皮素（一種黃酮物質）的聯合使用而逆轉。同時柯因可以降低肝臟MAD的水平，對TCCD誘導的脂質過氧化具有保護作用。此前，Ciftci等[31]的研究結果也顯示：柯因處理（每天灌胃50 mg/kg）可顯著緩解TCDD在大鼠上所導致的TBARS含量顯著上升、細胞因子TNF-α水平顯著升高以及干擾素γ（IFN-γ）的水平顯著下降等負面效應。這些結果說明柯因可以通過調節機體的抗氧化水平，減少炎癥相關細胞因子的分泌，從而緩解TCDD所誘導的肝組織損傷。

1.4 酒精（乙醇）

酒精性肝病是全世界范圍內一種常見的慢性肝病。長期攝入酒精會導致一系列嚴重疾病，包括酒精性脂肪肝、高甘油三酯血癥、肝硬化、心血管疾病和胰腺炎癥等[32]。乙醇是一種脂溶性非電解質，經由胃腸道吸收后擴散入血液，進而分布于全身。乙醇在體內的氧化分解主要經乙醇脫氫酶（ADH）代謝為乙醛，乙醇還可被微粒體乙醇氧化系統（MEOS）以及過氧化酶體中的過氧化氫酶作用生成乙醛，乙醛再經乙醛脫氫酶（ALDH）氧化為乙酸[33]。乙醇在這三條代謝路徑中所產生的乙醛均可導致自由基的產生，從而誘導肝臟損傷[34]。此外，乙醛還可與蛋白質、核酸等大分子互作，形成加合物。體內外的實驗結果均顯示，乙醛具有直接的致突變和致癌作用，可在人淋巴細胞上導致點突變，誘導姐妹染色單體交換及染色體異常[35]。

研究表明[36]，乙醇的攝入會破壞機體促氧化（pro-oxidant）和抗氧化（anti-oxidant）能力之間的微妙平衡，誘導更多自由基（羥乙基自由基、超氧化物自由基、羥基自由基、過氧化氫自由基等）的產生從而引起氧化應激，而這些自由基亦可誘導脂質過氧化，從而使肝細胞膜被破壞、細胞受損。此外，乙醇誘導產生的ROS和活性氮（RNS）還可通過激活巨噬細胞（枯否氏細胞）、促進促炎癥因子（如TNF-α、白細胞介素IL-1B、IL-6）的釋放誘導肝臟炎癥導致肝損傷[37]。

氧化應激在乙醇誘導肝損傷的病理中是重要的一環。Sathiavelu等[38]在乙醇誘導所致肝損傷的雌性Wistar大鼠上的研究表明：柯因灌胃處理（20 mg/kg）可以顯著降低TBARS含量，降低脂質過氧化物和共軛二烯的水平，顯著提高肝臟組織中SOD、CAT、GPx、谷胱甘肽還原酶（GR）、谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）的活性以及還原型谷胱甘肽、VC及VE的水平，說明柯因對乙醇誘導產生的自由基所介導的氧化應激具有顯著的保護作用。同時，組織學的結果也證實柯因對乙醇誘導的肝損傷具有明顯的緩解作用。同樣，Tahir和Sultana[39]在雄性Wistar大鼠上的研究也表明：柯因灌胃處理（20～40 mg/kg）可使乙醇所誘導的、肝臟組織中顯著升高的ADH、CYP 2E1（MEOS中將乙醇代謝為乙醛的一個重要酶）以及另一肝臟氧化損傷指標——黃嘌呤氧化酶（XO）的活性恢復至正常大鼠水平，使乙醇所致枯竭的、與谷胱甘肽有關的肝臟氧化應激指標（GSH、GD、GR）及CAT也恢復至正常水平。這些研究均表明：柯因是一種有效的自由基清除劑和氧化應激抑制劑，可以抑制乙醇代謝相關的酶的活性，增強肝臟抗氧化相關的酶水平，在緩解乙醇所致的肝損傷上具有顯著的肝保護作用。

2 柯因在由抗腫瘤藥物所引發的肝損傷中的作用

2.1 氨甲蝶呤（MTX）

MTX是一種葉酸拮抗劑，能抑制二氫葉酸還原酶的活性，從而干擾核酸的生物合成，在一系列腫瘤和自身免疫性疾病的治療中是被廣泛使用的、有效的化療藥物。然而，氨甲蝶呤對組織器官（如肝、腎、胃腸道、神經等）的毒性作用限制了其臨床上的使用，其中，肝臟毒性是其主要的副作用[40]。目前，一種理論認為MTX誘導肝損傷主要是因為細胞中的MTX以聚谷氨酸鹽的形式積聚，導致了葉酸的耗竭，從而導致肝損傷。還有理論則認為MTX通過降低肝細胞的抗氧化防御能力使其對ROS更為敏感，而ROS介導的脂質過氧化破壞了肝細胞膜的結構，影響了細胞的正常功能，ROS還可導致DNA損傷，從而促使細胞凋亡[41]。由于MTX無法區分正常細胞和腫瘤細胞，使得正常肝細胞也走向凋亡，導致肝損傷的發生。

許多研究已經證實，在MTX誘導的多器官損傷，特別是肝損傷中，氧化應激起了主要作用，而具有抗氧化活性的柯因可以顯著降低諸多肝臟氧化應激標志物的水平，減輕MTX在肝組織中引起的病理學變化，抑制細胞凋亡，從而對肝臟起到保護作用。Ali等[42]在雄性Wistar大鼠上的研究表明，柯因能夠顯著降低血清中ALT、AST、乳酸脫氫酶（LDH）的活性，顯著降低MAD的含量，升高與肝臟抗氧化能力密切相關的GPx、GR、SOD、CAT以及谷胱甘肽的含量，恢復、提高肝細胞的抗氧化防御能力。組織病理學觀察結果發現：柯因處理可顯著緩解MTX所導致的肝細胞異常、變形，同時，柯因還可下調與細胞凋亡密切相關的蛋白，如轉錄因子p53、促細胞凋亡蛋白BcL-2家族成員Bax蛋白以及半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）的表達，從而抑制細胞凋亡。

2.2 順氯氨鉑（順鉑）

順鉑是一種有效的、被廣泛使用的化療藥物，用于治療多種惡性腫瘤，但順鉑的治療作用因其具有劑量依賴的肝腎毒性而受到限制。其中，順鉑誘導的肝毒性與肝臟氧化應激和炎癥密切相關。

Rehman等[43]在雄性Wistar大鼠上的研究結果顯示，由腹腔注射順鉑所導致的肝臟損傷，可以通過對大鼠進行灌胃柯因（25～50 mg/kg）預處理來緩解。柯因能夠緩解肝臟脂質過氧化，降低黃嘌呤氧化酶XO的活性，改善肝臟谷胱甘肽的耗竭，提高多種抗氧化相關酶（如CAT、GR、GPx、SOD）的活性，并增加II相解毒酶（如谷胱甘肽-S-轉移酶和醌還原酶）的活性；同時柯因還下調了COX-2的表達以及損傷后被誘導表達的、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的表達，降低了細胞因子NF-κB、TNF-α的水平，并在組織學上緩解順鉑誘導的肝組織損傷。因此，柯因可以通過減輕氧化應激和炎癥響應來緩解順鉑對肝臟的毒性作用。

3 柯因在由高脂日糧所引發的肝損傷中的作用

由巨噬細胞發動的炎癥是機體防御有害刺激的一種保護性生理反應，然而，持續的炎癥導致組織損傷和壞死，從而引起一系列疾病，甚至是癌的發生[44]。已知巨噬細胞可以通過極化分型對不同微環境下的炎癥平衡進行調節。巨噬細胞的極化分型按照其功能分為兩個亞群（M1型和M2型），以分泌促炎因子為主、發揮促炎功能的巨噬細胞稱為M1型巨噬細胞，而以發揮降低炎癥反應、發揮組織修復功能為主的巨噬細胞稱為M2型巨噬細胞[45]。因此，基于巨噬細胞M1/M2比例的調控可能是消滅炎癥、篩選藥物的新途徑。

在小鼠和大鼠上的研究都表明：高脂日糧可導致肝臟炎癥的發生[46-48]。高脂日糧一方面可使肝臟中出現不同程度的脂肪變性，肝細胞結構異常，小葉中心的肝細胞受到嚴重影響，肝細胞中含有大小不等的脂滴；另一方面，還導致肝臟炎癥反應，主要表現為巨噬細胞在肝臟的浸潤。Feng等[49]在雄性C57BL/6J小鼠上的研究顯示，對飼喂高脂日糧的小鼠進行腹腔注射柯因處理（25～30 mg/kg），不僅可以減輕高脂日糧所誘導的肝臟脂肪變性（抑制脂滴的出現），降低血清AST和ALT水平，而且可以顯著減輕肝臟炎癥。柯因顯著地抑制了單核細胞向成熟巨噬細胞的分化，減少了巨噬細胞在肝臟和脂肪組織中的浸潤，并且在體內和體外實驗中均可誘導巨噬細胞抗炎癥的M2表型而降低促炎癥的M1表型。進一步的研究發現：柯因對巨噬細胞極化狀態（M1/M2）的調控離不開過氧化物酶體增殖體激活受體γ（PPARγ），柯因通過轉錄激活PPARγ抑制很多促炎癥基因的表達（如NO合成酶、NF-κB和環氧酶），從而發揮其抗炎癥和免疫調節的作用。

4 柯因在治療肝臟腫瘤中的積極作用

肝臟腫瘤是全世界范圍內的常發性腫瘤，其中，由肝臟腫瘤引發的死亡人數在東亞地區（尤其是中國）是最高的，約占總數的50%[50]。盡管通過手術治療、肝臟移植以及化療等多種手段可以延長肝癌患者的生存年限，但腫瘤的復發以及耐藥性的問題仍使肝癌的致死率居高不下[51]。根據腫瘤干細胞假說，腫瘤中存在的、能夠耐受化療的腫瘤干細胞（CSCs）促使了腫瘤的復發[52]。這些腫瘤干細胞是預防和治療腫瘤的有效靶標，然而，目前針對肝臟腫瘤的化療或放療措施均無法有效殺死這些腫瘤干細胞，最終導致了腫瘤的復發及轉移。在腫瘤發生機制上，目前已知干細胞激活劑，如Wnt/β-連環蛋白（β-catenin）和轉化生長因子TGF-β、Notch及Hedgehog信號途徑都可加速腫瘤的發生[53]。已有的研究表明柯因具有抗腫瘤活性，在抑制腫瘤細胞的再生以及誘導腫瘤細胞凋亡方面效果顯著。

4.1 柯因作用于腫瘤干細胞

Quan等[54]在肝臟腫瘤干細胞（LCSCs）上的研究表明：Wnt3a蛋白可以誘導β-catenin穩定，從而使LCSCs中β-catenin的濃度上升，而8-溴-7-甲氧基白楊素（BrMC），一種合成的柯因類似物，能夠降低LCSCs中β-catenin的表達，優先抑制LCSCs的增殖和自我更新，顯著抑制上皮細胞間質轉型EMT（epithelial-mesenchymal transition）以及LCSCs的入侵，并能有效清除LCSCs。Zou等[55]的研究結果顯示：來自人肝癌細胞系SMMC-7721的球形成細胞（SFCs）具有肝臟腫瘤干細胞的特性，目前肝細胞癌的臨床用治療藥物——索拉非尼，能夠降低其自我更新的能力，下調干細胞標志物（如CD133、CD44和ALDH1）的表達。BrMC與索拉非尼聯合使用，不僅可表現出正協同效應，而且可顯著降低干細胞的遷移和入侵、下調N-鈣粘蛋白（與癌細胞的侵襲與轉移有關）、上調E-鈣粘蛋白（抑癌基因CDH1的表達產物），促進細胞凋亡；且BrMC與索拉非尼對腫瘤干細胞的協同抑制效應是通過下調轉錄因子HIF-1α和上皮細胞間質轉型EMT的調控物Twist1來實現的；這一研究結果和之前Ren等[56]的結果相一致。

4.2 柯因促使腫瘤細胞凋亡

柯因還具有促進肝臟腫瘤細胞凋亡的活性[57]。例如，Li等[58]認為柯因能夠使腫瘤細胞對TNF-α誘導的細胞凋亡更加敏感。Huang等[59]的研究發現：柯因和芹黃素（4',5,7-三羥基黃酮）的聯合使用，可以降低人肝癌細胞HepG2的活力、抑制其增殖，誘導細胞凋亡，并且指出其作用機制是通過下調肝臟腫瘤中過表達的兩個蛋白：細胞S期激酶相關蛋白2（Skp2）和低密度脂蛋白受體相關蛋白6（LRP6）的表達來介導的。同樣，Li等的研究結果顯示[60]：柯因與順鉑的聯合使用可以促進HepG2細胞的凋亡，且這種作用是通過上調與細胞凋亡密切相關的轉錄因子p53蛋白實現的，即通過激活HepG2中的細胞外調節蛋白激酶ERK1/2促使p53的磷酸化及積累，從而導致BcL-2家族成員中促細胞凋亡蛋白Bax的過表達以及死亡受體DR5蛋白的過表達，而抑制BcL-2家族成員中抗細胞凋亡蛋白的表達。Yang等[61]的研究結果則顯示：BrMC可通過增加ROS的產生促進肝臟腫瘤細胞（HepG2、Bel-7402以及L-02）的凋亡。Zhang等[62]的研究結果也表明：富含柯因的益智石油醚提取物作用于人肝癌HepG2細胞，可促進LDH的釋放、擾亂線粒體膜電位、增加細胞內ROS、誘導HepG2細胞的凋亡，其機制是通過增加Bax/Bcl-2的比率、活化caspase-3/9促進細胞凋亡。這些結果提示，在對腫瘤細胞凋亡的調節上，柯因與不同物質的組合，其調節方式可能具有雙向性，在與抗腫瘤藥物聯合使用對抗其負面效應時表現出抑制正常細胞凋亡的特性，而與化療藥物同時使用或單獨使用時，可以防止腫瘤細胞對藥物的抗性，在腫瘤細胞中表現出促進細胞凋亡的作用特點。

在體內實驗中，柯因同樣表現出顯著的促腫瘤細胞凋亡活性。Khan等[63]在雄性Wistar大鼠上利用二乙基亞硝胺（DEN）誘導肝癌發生后，對其進行柯因（250 mg/kg）灌胃處理。其結果顯示，柯因顯著減少了結節的數量和大小；血清中AST、ALT、ALP、LDH和γGT的活性顯著降低；COX-2、NF-κB及p65的mRNA及蛋白水平均顯著下降，而與細胞凋亡過程密切相關的p53、Bax和caspase3的mRNA及蛋白水平則顯著上升；同時β-抑制蛋白（β-arrestin）和抗凋亡的標志物Bcl-xL的水平下降，說明柯因具有全面的肝保護作用，且其作用主要是通過p53介導的細胞凋亡。同樣，柯因的甲基化衍生物——二甲氧基黃酮（DMF），在雄性Wistar大鼠上（100 mg/kg）也可顯著抑制DEN所誘導的癌前病變，其機制與抑制Wnt路徑以及NF-κB所介導的炎癥反應有關[64]。

4.3 柯因的其他抑癌作用機制

腫瘤干細胞存在多種致病機制，維持腫瘤干細胞生存的因素，如血管發生與生成、入侵與遷移、組織低氧、免疫逃避、多種藥物及放射耐受性等，都與其活性有關。Zhao等[65]的研究顯示，柯因是云南栘中的一種主要黃酮物質，在體外試驗中，柯因表現出對多種培養的腫瘤細胞（包括人Huh7肝腫瘤細胞系）都具有顯著的細胞毒性作用；在體內實驗中，通過皮下注射肝腹水瘤H22細胞在昆明鼠上誘導移植性腫瘤，柯因不僅通過活化caspase-3誘導細胞凋亡，而且還抑制血管內皮生長因子（VEGF）的產生、抑制血管生成，從而發揮抗腫瘤的活性。

腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性一直是導致化療策略失敗的主要原因，理論上聯合用藥可促進藥物同時作用于多個細胞過程，干擾其耐藥機制，從而對抗腫瘤的生長和發展。柯因對腫瘤細胞的顯著毒性以及其對正常細胞不具有毒性作用的特點使其成為與抗腫瘤藥物聯合使用的首選。

5 結論

體內外的實驗證明：在多種肝臟損傷形式中，柯因具有優化血清指標、恢復肝組織的正常結構、緩解肝臟的氧化應激、抑制促炎癥細胞因子的釋放、緩解炎癥等顯著的肝保護效應，同時，柯因能使腫瘤細胞對藥物更敏感或直接殺傷腫瘤細胞，促進肝臟腫瘤細胞凋亡。隨著對柯因肝臟保護功能作用機制研究的深入，聯合應用多種含有柯因的天然植物提取物及其他對肝臟具有保護、治療效果的藥物將是未來治療各種肝臟疾病、防治肝臟腫瘤的一個主要研究方向。柯因是蜂膠黃酮的一個主要組分，作為一種可食用的黃酮，其廣泛的生物來源也使其成為一種具有潛力的新藥開發來源，擁有廣闊的應用前景。

參考文獻

[1]Gardana C, Scaglianti M, Pietta P, et al.Analysis of the polyphenolic fraction of propolis from different sources by liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J].J Pharm Biomed Anal, 2007, 45(3): 390-399.

[2]Garcia-Lafuente A, Guillamon E, Villares A, et al.Flavonoids as antiin fl ammatory agents: implications in cancer and cardiovascular disease [J].In fl amm Res, 2009, 58(9): 537-552.

[3]Khoo BY, Chua SL, Balaram P.Apoptotic effects of chrysin in human cancer cell lines [J].Int J Mol Sci, 2010, 11(5): 2188-2199.

[4]Anand KV, Mohamed Jaabir MS, Thomas PA, et al.Protective role of chrysin against oxidative stress in d-galactose-induced aging in an experimental rat model [J].Geriatr Gerontol Int, 2012, 12(4): 741-750.

[5]Chen SS, Corteling R, Stevanato L, et al.Polyphenols inhibit indoleamine 3,5-dioxygenase-1 enzymatic activity--a role of immunomodulation in chemoprevention [J].Discov Med, 2012, 14(78): 327-333.

[6]Anandhi R.Evaluation of the anti-atherogenic potential of chrysin in Wistar rats [J].Mol Cell Biochem, 2014, 385(1-2): 103-113.

[7]Sultana S, Verma K, Khan R.Nephroprotective efficacy of chrysin against cisplatin-induced toxicity via attenuation of oxidative stress [J].J Pharm Pharmacol, 2012, 64(6): 872-881.

[8]Khan R, Khan AQ, Qamar W, et al.Chrysin protects against cisplatininduced colon.toxicity via amelioration of oxidative stress and apoptosis:probable role of p38MAPK and p53 [J].Toxicol Appl Pharmacol, 2012,258(3): 315-329.

[9]El-Bassossy HM, Abo-Warda SM, Fahmy A.Chrysin and luteolin attenuate diabetes-induced impairment in endothelial-dependent relaxation:effect on lipid pro fi le, AGEs and NO generation [J].Phytother Res, 2013,27(11): 1678-1684.

[10]Sirovina D, Orsolic N, Koncic MZ, et al.Quercetin vs chrysin: effect on liver histopathology in diabetic mice [J].Hum Exp Toxicol, 2013,32(10): 1058-1066.

[11]Lo HM, Wu MW, Pan SL, et al.Chrysin restores PDGF-induced inhibition on protein tyrosine phosphatase and reduces PDGF signaling in cultured VSMCs [J].J Nutr Biochem, 2012, 23(6): 667-678.

[12]Manibusan MK, Odin M, Eastmond D.Postulated carbon tetrachloride mode of action: a review [J].J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev, 2007, 25(3): 185-209.

[13]Tirkey N, Pilkhwal S, Kuhad A, et al.Hesperidin, a citrus bio fl avonoid,decreases the oxidative stress produced by carbon tetrachloride in rat liver and kidney [J].BMC Pharmacol, 2005, 5(1): 2.

[14]Zhang Q, Hu X, Hui F, et al.Ethanol extract and its dichloromethane fraction of Alpinia oxyphylla Miquel exhibited hepatoprotective effects against CCl4-induced oxidative damage in vitro and in vivo with the involvement of Nrf2 [J].Biomed Pharmacother, 2017, 91: 812-822.

[15]Chen XL, Dodd G, Thomas S, et al.Activation of Nrf2/ARE pathway protects endothelial cells from oxidant injury and inhibits inflammatory gene expression [J].Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2006, 290(5): H1862-1870.

[16]Dong D, Zhang S, Yin L, et al.Protective effects of the total saponins from Rosa laevigata Michx fruit against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in mice [J].Food Chem Toxicol, 2013, 62(6): 120-130.

[17]Kamel R, El Morsy EM.Hepatoprotective effect of methylsulfonylmethane against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats [J].Arch Pharm Res, 2013, 36(9): 1140-1148.

[18]Gao B.Hepatoprotective and anti-in fl ammatory cytokines in alcoholic liver disease [J].J Gastroenterol Hepatol, 2012, 27 (Suppl 2): 89-93.

[19]Hermenean A, Mariasiu T, Navarro-Gonzalez I, et al.Hepatoprotective activity of chrysin is mediated through TNF-alpha in chemically-induced acute liver damage: An in vivo study and molecular modeling [J].Exp Ther Med, 2017, 13(5): 1671-1680.

[20]Friedman SL.Mechanisms of hepatic fibrogenesis [J].Gastroenterology, 2008, 134(6): 1655-1669.

[21]Breitkopf K, Godoy P, Ciuclan L, et al.TGF-beta/Smad signaling in the injured liver [J].Z Gastroenterol, 2006, 44(1): 57-66.

[22]Horiguchi M, Ota M, Rifkin DB.Matrix control of transforming growth factor-beta function [J].J Biochem, 2012, 152(4): 321-329.

[23]Balta C, Herman H, Boldura O, et al.Chrysin attenuates liver fi brosis and hepatic stellate cell activation through TGF-beta/Smad signaling pathway [J].Chem Biol Interact, 2015, 240: 94-101.

[24]Farghali H, Kgalalelo KM, Wojnarova L, et al.In vitro and in vivo experimental hepatotoxic models in liver research: applications to the assessment of potential hepatoprotective drugs [J].Physiol Res, 2016,65(Suppl 4): S417-S425.

[25]Keppler DO, Pausch J, Decker K.Selective uridine triphosphate de fi ciency induced by D-galactosamine in liver and reversed by pyrimidine nucleotide precursors.Effect on ribonucleic acid synthesis [J].J Biol Chem,1974, 249(1): 211-216.

[26]Stachlewitz RF, Seabra V, Bradford B, et al.Glycine and uridine prevent D-galactosamine hepatotoxicity in the rat: role of Kupffer cells [J].Hepatology, 1999, 29(3): 737-745.

[27]Pushpavalli G, Veeramani C, Pugalendi KV.Influence of chrysin on hepatic marker enzymes and lipid profile against D-galactosamine-induced hepatotoxicity rats [J].Food Chem Toxicol, 2010, 48(6): 1654-1659.

[28]Pushpavalli G, Kalaiarasi P, Veeramani C, et al.Effect of chrysin on hepatoprotective and antioxidant status in D-galactosamine-induced hepatitis in rats [J].Eur J Pharmacol, 2010, 631(1-3): 36-41.

[29]Hassoun EA, Li F, Abushaban A, et al.The relative abilities of TCDD and its congeners to induce oxidative stress in the hepatic and brain tissues of rats after subchronic exposure [J].Toxicology, 2000, 145(2-3): 103-113.

[30]Ciftci O, Vardi N, Ozdemir I.Effects of quercetin and chrysin on 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin induced hepatotoxicity in rats [J].Environ Toxicol, 2013, 28(3): 146-154.

[31]Ciftci O, Ozdemir I.Protective effects of quercetin and chrysin against 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) induced oxidative stress, body wasting and altered cytokine productions in rats [J].Immunopharmacol Immunotoxicol, 2011, 33(3): 504-508.

[32]Ponnappa BC, Rubin E.Modeling alcohol’s effects on organs in animal models [J].Alcohol Res Health, 2000, 24(2): 93-104.

[33]Nordmann R.Alcohol and antioxidant systems [J].Alcohol Alcohol,1994, 29(5): 513-522.

[34]Lieber CS.Metabolism of alcohol [J].Clin Liver Dis, 2005, 9(1): 1-35.[35]Helander A, Lindahl-Kiessling K.Increased frequency of acetaldehydeinduced sister-chromatid exchanges in human lymphocytes treated with an aldehyde dehydrogenase inhibitor [J].Mutat Res, 1991, 264(3): 103-107.

[36]Nordmann R, Ribière C, Rouach H.Implication of free radical mechanisms in ethanol-induced cellular injury [J].Free Radical Biology and Medicine, 1992, 12(3): 219-240.

[37]Enomoto N, Ikejima K, Bradford BU, et al.Role of Kupffer cells and gut-derived endotoxins in alcoholic liver injury [J].J Gastroenterol Hepatol, 2000, 15(Suppl): D20-25.

[38]Sathiavelu J, Senapathy GJ, Devaraj R, et al.Hepatoprotective effect of chrysin on prooxidant-antioxidant status during ethanol-induced toxicity in female albino rats [J].J Pharm Pharmacol, 2009, 61(6): 809-817.

[39]Tahir M, Sultana S.Chrysin modulates ethanol metabolism in Wistar rats:a promising role against organ toxicities [J].Alcohol Alcohol, 2011, 46(4): 383-392.

[40]Jahovic N, Cevik H, Sehirli AO, et al.Melatonin prevents methotrexate-induced hepatorenal oxidative injury in rats [J].J Pineal Res,2003, 34(4): 282-287.

[41]Tunali-Akbay T, Sehirli O, Ercan F, et al.Resveratrol protects against methotrexate-induced hepatic injury in rats [J].J Pharm Pharm Sci, 2010,13(2): 303-310.

[42]Ali N, Rashid S, Nafees S, et al.Bene fi cial effects of Chrysin against Methotrexate-induced hepatotoxicity via attenuation of oxidative stress and apoptosis [J].Mol Cell Biochem, 2014, 385(1-2): 215-223.

[43]Rehman MU, Ali N, Rashid S, et al.Alleviation of hepatic injury by chrysin in cisplatin administered rats: probable role of oxidative and in fl ammatory markers [J].Pharmacol Rep, 2014, 66(6): 1050-1059.

[44]Nathan C, Ding A.Nonresolving inflammation [J].Cell, 2010, 140(6): 871-882.

[45]周憲賓.巨噬細胞M1/M2極化分型的研究進展[J].中國免疫學雜志，2012, 28(10): 957-960.

[46]Jakobsdottir G, Xu J, Molin G, et al.High-fat diet reduces the formation of butyrate, but increases succinate, in fl ammation, liver fat and cholesterol in rats, while dietary fi bre counteracts these effects [J].PLoS One, 2013, 8(11): e80476.

[47]Uetake Y, Ikeda H, Irie R, et al.High-salt in addition to high-fat diet may enhance in fl ammation and fi brosis in liver steatosis induced by oxidative stress and dyslipidemia in mice [J].Lipids Health Dis, 2015, 14(1): 6.

[48]van der Heijden RA, Sheedfar F, Morrison MC, et al.High-fat diet induced obesity primes inflammation in adipose tissue prior to liver in C57BL/6j mice [J].Aging (Albany NY), 2015, 7(4): 256-268.

[49]Feng X, Qin H, Shi Q, et al.Chrysin attenuates inflammation by regulating M1/M2 status via activating PPARgamma [J].Biochem Pharmacol, 2014, 89(4): 503-514.

[50]Jemal A, Bray F, Center MM, et al.Global cancer statistics [J].CA Cancer J Clin, 2011, 61(2): 69-90.

[51]Ferlay J, Shin HR, Bray F, et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008 [J].Int J Cancer, 2010, 127(12): 2893-2917.

[52]Oishi N, Wang XW.Novel therapeutic strategies for targeting liver cancer stem cells [J].Int J Biol Sci, 2011, 7(5): 517-535.

[53]Yamashita T, Budhu A, Forgues M, et al.Activation of hepatic stem cell marker EpCAM by Wnt-beta-catenin signaling in hepatocellular carcinoma [J].Cancer Res, 2007, 67(22): 10831-10839.

[54]Quan MF, Xiao LH, Liu ZH, et al.8-bromo-7-methoxychrysin inhibits properties of liver cancer stem cells via downregulation of beta-catenin [J].World J Gastroenterol, 2013, 19(43): 7680-7695.

[55]Zou H, Cao X, Xiao Q, et al.Synergistic inhibition of characteristics of liver cancer stem-like cells with a combination of sorafenib and 8-bromo-7-methoxychrysin in SMMC-7721 cell line [J].Oncol Rep, 2016,36(3): 1731-1738.

[56]Ren KQ, Cao XZ, Liu ZH, et al.8-bromo-5-hydroxy-7-methoxychrysin targeting for inhibition of the properties of liver cancer stem cells by modulation of Twist signaling [J].Int J Oncol, 2013, 43(5):1719-1729.

[57]Sun X, Huo X, Luo T, et al.The anticancer fl avonoid chrysin induces the unfolded protein response in hepatoma cells [J].J Cell Mol Med, 2011,15(11): 2389-2398.

[58]Li X, Huang Q, Ong CN, et al.Chrysin sensitizes tumor necrosis factor-alpha-induced apoptosis in human tumor cells via suppression of nuclear factor-kappaB [J].Cancer Lett, 2010, 293(1): 109-116.

[59]Huang C, Wei YX, Shen MC, et al.Chrysin, abundant in Morinda citrifolia fruit water-EtOAc extracts, combined with apigenin synergistically induced apoptosis and inhibited migration in human breast and liver cancer cells [J].J Agric Food Chem, 2016, 64(21): 4235-4245.

[60]Li X, Huang JM, Wang JN, et al.Combination of chrysin and cisplatin promotes the apoptosis of HepG2 cells by up-regulating p53 [J].Chem Biol Interact, 2015, 232: 12-20.

[61]Yang XH, Zheng X, Cao JG, et al.8-Bromo-7-methoxychrysin-induced apoptosis of hepatocellular carcinoma cells involves ROS and JNK [J].World J Gastroenterol, 2010, 16(27): 3385-3393.

[62]Zhang Q, Cui C, Chen CQ, et al.Anti-proliferative and pro-apoptotic activities of Alpinia oxyphylla on HepG2 cells through ROS-mediated signaling pathway [J].J Ethnopharmacol, 2015, 169: 99-108.

[63]Khan MS, Devaraj H, Devaraj N.Chrysin abrogates early hepatocarcinogenesis and induces apoptosis in N-nitrosodiethylamineinduced preneoplastic nodules in rats [J].Toxicol Appl Pharmacol, 2011,251(1): 85-94.

[64]Khan MS, Halagowder D, Devaraj SN.Methylated chrysin induces coordinated attenuation of the canonical Wnt and NF-kB signaling pathway and upregulates apoptotic gene expression in the early hepatocarcinogenesis rat model [J].Chem Biol Interact, 2011, 193(1): 12-21.

[65]Zhao X, Shu G, Chen L, et al.A fl avonoid component from Docynia delavayi (Franch.) Schneid represses transplanted H22 hepatoma growth and exhibits low toxic effect on tumor-bearing mice [J].Food Chem Toxicol, 2012, 50(9): 3166-3173.