多重PCR技術在實驗動物病原檢測中的應用

張飛燕，趙 玲，金 潔，王 蕓，呂龍寶,2*

(1.中國科學院昆明動物研究所，昆明 650000； 2.中國科學院昆明靈長類研究中心，昆明 650223)

實驗動物是生命科學研究的基礎和條件，實驗動物的質量直接影響眾多領域科學實驗的準確性，也關系到實驗動物從業人員和動物實驗操作者的健康[1]。因此，實驗動物的質量控制成為制約性要素，實驗動物的微生物、寄生蟲質量控制顯得尤為重要。目前，實驗動物微生物學等級及監測國標GB 14922.2-2011，針對細菌檢測推薦的方法是病原菌的分離培養、生化鑒定，但耗時長，操作繁瑣，易受檢測人員的主觀判定干擾；針對病毒檢測主要采取血清學方法檢測，但對于一些動物病毒呈周期性病毒，在排毒的時候，體內無抗體，通過血清學方法檢測，就易造成假陰性。針對寄生蟲檢測主要采用直接涂片法或飽和氯化鈉漂浮法，也受檢測人員的判定干擾。此外，實驗動物多采用群體飼養，易被各種易感病原所感染，從而導致疾病的爆發和流行，嚴重影響經濟效益，并使公共衛生遭到威脅[2]。因此，建立一種快速、敏感、易于標準化操作的檢測技術尤為重要。多重PCR是近年來興起的一種新型檢測手段，實現在同一反應體系對多種病原微生物的檢測，或對遺傳病、癌基因、耐藥基因的分型鑒定，具有高效、快速、經濟簡便等優點，實現對實驗動物多種病原微生物或具體哪一型病原體感染的鑒別診斷，以及為一些人獸共患病原如猴B病毒的監測提供強有力的保障，在臨床上具有很高的應用價值[3]。筆者將多重PCR技術應用在實驗動物疫病病原體的檢測綜述如下，并提出多重PCR未來應用前景的展望。

1 多重PCR的原理及技術特點

多重PCR反應原理與普通PCR反應原理與試劑基本相同，通過模板DNA與引物之間的變性、退火和延伸三個步驟為一個循環，每次循環產生的DNA片段為下次循環的模板。多重PCR反應就是在一個PCR反應體系里，同時擴增多個核酸片段或同一核酸片段的不同區域。目前，有很多文獻對影響PCR反應的質量條件進行了討論，然而對影響多重PCR實驗的關鍵因素鮮有報道。多重PCR與單重PCR最大的不同就是多對引物，因此各引物之間的濃度搭配影響最大，其次是由于擴增多個目的DNA，因此在Mg2+、dNTP的用量上面都需要做一些調整。大量實驗研究報告也指出，影響多重PCR成功的主要因素是：多重PCR體系里不同基因的引物對濃度、退火溫度、底物濃度應達到平衡。在最初進行多重PCR反應時，需要先優化單重PCR的引物濃度、底物濃度、退火溫度這三大重要因素，再對多重PCR體系里各引物對濃度比例、底物濃度、退火溫度探討。首先，多重PCR引物的設計必須滿足每對單引物的設計原則，根據靶基因設計的各引物對應具有高度的特異性，引物長度為20 bp左右，引物的GC含量應不小于35%，大于60%[4]；其次，多重PCR反應體系里，各引物對的濃度很重要[5]。大部分文獻研究報道，在最初的多重PCR反應體系里，需要不斷的優化多重PCR各引物對濃度，各引物對的濃度搭配會影響某些基因的擴增量[6-7]。解決這一問題，需要改變反應中各種引物的比例，增加“弱”基因的引物量，減少“強”基因的引物量[8]。退火溫度也是影響多重PCR反應的一個重要參數，大部分學者經驗表明多重PCR里的退火溫度要比單獨擴增時的退火溫度低4℃左右，退火溫度55℃左右，效果最優[9]，并建議所有引物對的最適退火溫度要盡可能的相同，這樣有助于多重PCR選擇的退火溫度保證每對引物都有相同的擴增率[10]。也有學者提出，高的退火溫度使基因的擴增量減少，盡管可用延長退火和延伸時間來解決這一問題。也有文獻報道指出，多重PCR實驗中，通過增長延伸時間能提高PCR產物的產量。Henegariu等[11]研究報道，在一個X、Y染色體引物同時擴增實驗中，通過增加延伸時間，發現PCR產物的產量也增加了，同時試圖增加一個反應體系擴增4個Y 染色體上的基因的延伸時間，也發現PCR產物的產量增加。對于dNTP濃度，大量實驗研究證明，使用dNTP 濃度較低(最低50 μmol/L)，不抑制擴增，但會使擴增產物量減少；dNTP 濃度大于400 μmol/L時，擴增被迅速抑制[12-14]。另外，也有研究報道緩沖液中dNTP、MgCl2、KCl濃度的平衡，也影響著擴增的效率[15]。有研究指出，Mg2+能提高Taq DNA 聚合酶的活性，能提高擴增效率；同時指出長片段的擴增引物在低鹽濃度下擴增效率更高好，短片段的擴增引物在高鹽濃度下擴增效率更好[16]。此外，dNTP母液避免反復凍融。最后，對于反應體系中佐劑的使用，大部分學者認為在反應體系里加DMSO和甘油(參考范圍為：5%～10% (V/V))，可提高產物量和特異性[17]。一部分學者認為，加入0.8 μg/ μL BSA能更好的提高PCR擴增效率[18]。然而，也有反對的聲音，在反應體系里加DMSO 會影響實驗結果。至于選擇什么樣的佐劑提高多重PCR擴增效率，有待更深入的研究。

多重PCR具有高效性，在同一PCR反應體系能同時檢出多種病原微生物，或進行基因分型，只需要動物的一滴血，一根毛發或組織分泌物就可檢測多種病原體。此外，多重PCR具有系統性，多重PCR適用于病毒、腸道細菌等多種混合病原體的檢測，理論上只要條件允許，引物對的數量可以不限，目前有擴增9條目的片段的記錄[19]。但該技術需要對反應體系和反應條件進行多次優化。另外，多重PCR技術能在同一反應體系快速鑒別診斷實驗動物多種病原體的混合感染，具有方便、快速、經濟適用的優點，能及時為臨床提供更多更準確的診斷信息。

2 多重PCR在細菌、真菌混合感染檢測中的應用

目前我國實驗動物微生物等級及監測標準GB 14922.2-2011，針對豚鼠、地鼠、兔、犬和猴；清潔級以上小鼠、大鼠病原菌檢測主要采用傳統的細菌培養、鏡檢、生化鑒定，此種方法費時費力。隨著分子生物學的快速發展，多重PCR技術可以同時對這幾種病原菌進行檢測，具有高靈敏度、高效、低成本等優點。

祝巖波等[20]建立了金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌多重PCR檢測方法，對76份感染的實驗動物糞便標本進行檢測，結果表明建立的多重PCR方法對每種病原菌DNA最低檢測質量能達到10 pg。王鵬飛等[21]建立了金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體多重PCR檢測方法，該方法對三種菌的檢測靈敏度達到1～10 pg。陸紅玉等[22]建立了適合食蟹猴志賀氏菌、沙門氏菌和小腸結腸炎耶爾森菌這三種致病菌快速檢測的多重PCR方法，該方法對137例食蟹猴肛拭子中志賀氏菌屬、沙門氏菌屬和小腸結腸炎耶爾森氏菌3 種病原菌檢測的靈敏度達到100～200 CFU/mL。上述三種多重PCR方法都與傳統分離培養方法和單重PCR方法比較，證實該方法能從混合感染的標本中，檢測出不同的病原菌，檢測結果的一致性為96%～100%，且細菌檢出率高于傳統分離培養方法，說明該方法具有很高的檢測靈敏度和特異性，具有很強的實用性和潛在的發展力。

邢進[23]等建立了石膏樣毛癬菌(Tm)、石膏樣小孢子菌(Mg)、犬小孢子菌(Mc)和猴類毛癬菌(Am)的多重PCR檢測方法，對260份實驗動物毛發樣本進行檢測，最低檢測限達到5.9 ～9.5 pg/μL，且檢測結果均為陰性，未發現4種真菌的感染，與SDA方法檢測結果一致，證明在實驗動物中的皮膚真菌感染率始終保持在極低水平；對15份人工感染四種不同真菌的大鼠毛發檢測，準確的檢測出不同的菌株組合。證明該法具有良好的可重復性、靈敏性、特異性，可用于在實驗動物皮膚病原真菌的快速檢測和篩查，具有較高的應用價值。

3 多重PCR在病毒性混合感染的病原檢測中的應用

目前實驗室病毒檢測方法主要參照國標GB 14922.2-2011，采用ELISA血清學的方法檢測，但這種方法的敏感性和特異性取決于抗原的制備[24]。經研究發現，病毒大量增殖時動物尚未產生抗體，隨著抗體的產生，病毒逐漸清除[25-26]。通常感染猴逆轉錄D型病毒(SRV)和猴T細胞趨向病毒1型(STLV-1)的獼猴通常不表現出臨床癥狀，體內可能會產生較低水平的抗體，或在感染后很長一段時間，體內仍無血清學轉化。因此檢測這兩種病毒不應采用血清學方法。為確保實驗結果的準確性，通常對所有血清學陰性的動物再次結合PCR進行檢測。李曉燕等[27]建立了一種能同時檢測獼猴STLV-1和SRV/D-1兩種逆轉錄病毒的多重PCR方法，結果顯示建立的多重PCR方法能同時檢測出獼猴體內可能存在的STLV-1和SRV/D-1 兩種逆轉錄病毒，可用于獼猴種群逆轉錄病毒的定性監測。

大量文獻對其它實驗動物，如大小鼠[28]、水貂[29]、犬[30]、樹鼩[31]、兔[32]等應用建立的多重PCR方法檢測病毒混合感染，結果表明所建立的多重PCR方法具有快速高效、特異性強、靈敏度高等優點，可用于實驗動物的質量監測。饒丹等[33]建立了鑒別檢測大鼠細小病毒(RPV)與其他三種大鼠細小病毒(H-1、KRV、RMV)的多重PCR方法，多重PCR結合測序在檢測23份臨床樣本中，PCR的最低檢測限可達1000拷貝每微升，檢測出30.43%的RMV陽性，具有靈敏度高及操作簡單等優點，是一種簡便、可靠的檢測方法。以及近來廣東實驗動物監測所設利用多重PCR技術和Luminex技術結合，建立了一種可以同時檢測大鼠5種病原體的方法；應用多重PCR熒光技術實現對小鼠腦脊髓炎病毒和大鼠泰勒病毒的檢測等，證實這兩種方法都具有快速高效、特異性強、靈敏度高、重復性好等優點。綜上所述，表明多重PCR技術應用于實驗動物病毒檢測有很大的優勢和發展潛力，利用多重PCR技術與其它新型技術結合應用于實驗動物的檢測，將是未來研究的一個方向。

4 多重PCR技術在細菌耐藥性方面的研究

動物濫用藥導致的細菌耐藥性已成為全世界關注的熱點問題，且我國動物源細菌性監測工作起步比較晚，動物源細菌耐藥性檢測能力仍嚴重不足[34]。大腸桿菌、沙門氏菌等是動物易感染的細菌，雖然可通過改善養殖條件和加強飼養管理來防治，但目前仍主要通過抗菌劑治療[35]。特別是針對實驗猴這類高等動物，沙門菌病和由志賀菌屬引起的細菌性痢疾是實驗猴常見的腸道病[36]。這兩種病治療均以抗菌為主，常選用氨芐西林、慶大霉素、氧氟沙星等來治療，抗生素雖在短期內可緩解腹瀉癥狀，但從整個慢性病程看，并無效[37]。目前，一些動物機構的養殖人員對抗生素的使用存在錯誤認識，認為多使用幾種抗生素總會有一種起作用，因此造成療效不確切時易產生交叉感染，使致病菌和條件致病菌耐藥性增強，而在有療效時也無法弄清是哪一種藥物起的作用[38]。并且還存在一些獸醫在動物輕微感染的情況下就使用抗生素，隨著時間的累積，一旦產生耐藥，將導致患病的實驗動物治療效果不理想。目前細菌耐藥性的監測手法主要為藥敏監測方法。藥敏試驗由于方便、簡捷、易判定的優點，尤其是藥敏紙片瓊脂擴散法，常用于臨床上指導用藥。但藥敏試驗是在體外用藥物試探性的檢驗細菌的表型耐藥特性，不能檢測細菌的隱型耐藥性，且藥敏實驗受不同藥敏試驗方法和判斷藥物敏感濃度差異等影響結果的準確性。另外，目前還存在一些動物機構，動物患病直接先上抗生素，再采樣進行培養及鑒定和藥敏檢測，根據這個流程，真正的致病菌往往已經受抗生素影響，等藥敏實驗的結果出來，往往出現藥敏結果與臨床療效不符合的情況。而多重PCR具有的快速、敏感、特異等優點，可以在同一反應體系檢測多種極微量的耐藥基因，能更準確有效的提供細菌耐藥的信息，且不需要經過費時的細菌培養，已廣泛的應用于細菌耐藥性的研究。楊鑫等[39]利用多重PCR方法篩選了豬源雞源大腸桿菌氯霉素類藥物耐藥基因(cat1、cmlA、flor)，建立了這3種耐藥基因篩選的三重試劑盒，并利用試劑盒對33株細菌的耐藥性進行檢測，同時將多重PCR檢測結果和藥敏試驗結果比較，表明兩者檢出的符合率為91%；共收集來自不同省豬、雞養殖場的417株細菌，進行豬源雞源大腸桿菌氯霉素抗性基因檢測，三種基因的檢出率分別為：41.5%、35.7%和37.2%，不同省的耐藥基因檢出率差異較明顯。目前，我國尚未有對猴場耐藥基因的分布及篩選的相關報道，大部分都是針對豬、雞養殖場的耐藥基因分布進行統計調查和篩選。因此，開發和建立一種能快速篩選病原微生物耐藥基因的方法，特別是針對實驗猴這類國家級保護動物，用于實驗動物耐藥性的研究，提高動物感染病原菌的治療率非常有必要。因此，多重PCR技術對推進病原物的耐藥性研究將具有十分重要的意義。

5 多重PCR技術的應用情景

多重PCR實驗技術在實驗動物的微生物、寄生蟲、細菌耐藥性等方面的檢測比單一的普通PCR技術具有方便、快捷的優點，一次可以同時檢測多種基因，即達到了保證實驗動物的質量，又節省了人力與物力。但多重PCR技術應用在實驗動物病原檢測中也存在不足。比如假陽性結果，研究人員可以通過對實驗室實現嚴格的分區，加強實驗室的管理，每次實驗設立嚴格的陰陽性對照等來消除。

多重PCR技術未來的研究主要集中在以下幾個方面。首先，多重PCR試劑盒在開發并應用于實驗動物的疫病檢測中，當前主要用于豬、牛羊、大小鼠的病原微生物診斷，而應用于實驗猴，樹鼩的檢測甚少。非人靈長類是人類的近親，在生物學、遺傳學和行為學等方面與人類高度相同，被廣泛的應用于多種疾病動物模型的研究[40-41]，是極其珍貴的實驗動物。樹鼩，由于其體型小，孕期短，生長快、容易飼養、在生物進化史上更接近人類等優點，作為一種新型的實驗動物資源，正受到廣泛的重視[42-43]。對實驗猴、樹鼩等其它一些新型的實驗動物攜帶的病毒、細菌、寄生蟲指標進行控制，開發和建立快速、可靠的新型監測手段非常迫切。因此，研制針對于猴、樹鼩等新型實驗動物疫病的多重PCR標準診斷試劑盒，用于動物疫病的監測，將有很大的應用前景。其二，多重PCR試劑盒具有的高效快捷、高度特異敏感等優點，在面對人獸共患病，公共衛生危機方面避免了耗時、大量的費力排查[44-45]。多重PCR試劑盒研發和生產，使其在公共衛生安全診斷中發揮更大的優勢，也是未來的一個發展方向。最后，多重PCR技術最大的價值在于它能提高診斷的敏感性。目前，后基因組時代，對基因組候選區段的重測序需求日益增加，人們對序列的關注超過了少數的SNP，候選區段的范圍可能在5～100 Kb之間，使用傳統sanger法或目標區域雜交捕獲測序價格昂貴，使用多重PCR目標區域捕獲測序很好的解決了這一難題。通過多重PCR對擴增整個基因區域，一次性捕獲，結合高通量測序技術，多樣本同時測序，在大樣本量篩查的同時極大的降低成本。另外，多重PCR技術與其它技術的整合應用，如多重PCR技術與LAMP、基因芯片等實驗技術結合，進一步提高動物病原檢測的靈敏性、可重復性，實現大批量實驗動物病原檢測、混合感染樣品基質中的多種微生物的有效檢測、實驗動物檢測的標準化，必將在未來實驗動物病原檢測中有很好的應用前景。