人類表皮細胞衰老相關的microRNA差異性表達與信號通路分析

韓銀淑

(廈門醫學院，廈門 361023)

人類的表皮是非常重要的天然屏障，用來抵御環境中化學、物理和微生物的影響。位于真皮與表皮連接處的基底層分布有干細胞，它不斷的分化成新的角質形成細胞(keratinocytes, KC)以更新表皮，而這些角質形成細胞在表層脫落的過程中分化、死亡。盡管表皮處于不斷更新的狀態，但隨著角質形成細胞更新速率的下降，衰老即產生。衰老與諸如表皮變薄、彈性組織缺失、黑色素細胞損失與皮膚蒼白和透明度增加以及屏障功能降低相關。相反，角質形成細胞過度活化會引起的表皮過度增生及炎癥細胞的浸潤導致的局部炎癥。如銀屑病，癌前期病變如光線性角化病，原位癌如Bowen病，皮膚癌如基底細胞癌，鱗狀細胞癌。角質形成細胞的分子機制和信號傳導途徑在很大程度上是未知的，本研究試圖通過基因調控的視角揭示參與人類表皮組織衰老的分子機制與信號通路。

miRNA是內源性22個核苷酸的小非編碼RNA，其通過靶向mRNAs并觸發翻譯抑制或RNA降解來控制基因表達[1]。這些非編碼RNA與靶mRNA的3’端結合，其結合的特異性主要由miRNA的啟動區域(從核苷酸2～8位)決定。通常情況下miRNA可同時調控數百個相同途徑的靶基因，并且為了增加這種轉錄后調節的復雜性，幾種miRNA可以靶向相同的轉錄物[2]。miRNAs是生物過程所必需的[3-4]。許多miRNA以組織特異性方式表達[5]。在橫紋肌中，miRNA參與其生理過程，如肌形成、纖維類型轉換和再生[6-8]。因此，miRNA表達水平的失調與病理狀態有關[9-10]。例如，SOD1G93 A轉基因小鼠中miRNA-206的抑制誘導嚴重萎縮[11]。然而，miRNA在人類表皮組織中的參與情況和所調控的信號通路很大程度上是未知的。

為了確定哪些miRNA和其調控的信號通路與表皮組織衰老過程相關，本課題組選擇了年輕人和老年人的表皮組織GEO芯片，檢查不同年齡下miRNA表達的差異，通過Cytoscape軟件(v.3.5.1)預測分析下游靶基因并篩選出關鍵基因分析其參與的細胞活動和參與的信號通路。總之，這些結果在一定程度上提示與衰老相關的miRNA在表皮細胞衰老過程中潛在的調控作用，為進一步治療和抵抗衰老提供新的理論依據和方法。

1 材料和方法

1.1 微陣列芯片分析

本研究使用二種芯片，包括基因芯片、miRNA芯片。使用GEO2R軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)分析芯片數據。在所有實驗組中，差異表達的基因，miRNA均通過顯著性水平P< 0.05或|logFC| > 1來鑒定。

1.2 功能富集分析

可視化集成數據庫v.6.8(DAVID v.6.8)用來進行基因注釋。“京都基因和基因組百科全書”(KEGG)和基因本體論(GO)用來對基因進行生物功能及通路分析。GO分析僅限用于生物過程分析。Cytoscape(v.3.5.1)平臺上的ClueGO和CluePedia插件用于可視化分析。GO術語基于共享基因的功能性進行連接，并根據功能相似性進行分組。

1.3 網絡建設和分析

關于蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)的信息來源于檢索相互作用的基因/蛋白質數據庫的搜索工具(https://string-db.org/)。選擇經實驗驗證，并且得分≥0.4的基因。關于miRNA基因相互作用的信息是使用Cytoscape上相互作用的miRNA基因的檢索工具(v.3.5.1)推導。

2 結果

2.1 通過生物信息學分析鑒定了年輕與老年表皮組織micRNA芯片

使用GEO2R方法的GEO數據庫篩選老年(55～66歲)和年輕人(20～25歲)角質形成細胞中差異表達的miRNA的分層聚類基因芯片(GSE101493)。結果顯示11個miRNA上調，18個miRNA下調(表1)。

2.2 通過生物信息學分析鑒定年齡差異的基因芯片

使用GEO2R方法的GEO數據庫篩選來自年輕人和老年人的表皮組織差異表達基因芯片(GSE18876)。篩查結果顯示，基于倍數變化(FC)或P值(| logFC |> 0.8或P< 0.05)，不同年齡表皮組織基因芯片中有105個差異表達基因。其中，有17個年齡相關基因共同上調，17個年齡相關基因共同下調。使用火山圖來顯示二種微陣列上所有基因的差異(圖1)。

2.3 年齡差異的miRNA與年齡差異基因的相互作用

為了提高預測的準確性，使用Cytoscape軟件(v.3.5.1)，選擇了差異最大的前5個上調的miRNA和前5個下調的miRNA，預測與它們相互作用基因。然后篩選了與基因芯片共表達的基因，為基因芯片中上調的基因與下調的miRNA預測的基因以及下調的基因與上調的miRNA預測基因的交集(圖3)。選擇差異最大的前5個下調的miRNA和前5個上調的miRNA用于互作網絡分析(圖4)。上調的miRNA預測靶基因與差異基因(下調)交集，如表2顯示，GO分析的結果為這些差異基因主要與ω羥化酶P450途徑、NO生物合成過程、氧化還原酶活性、芳香化酶活性、凋亡過程的正調控、氧結合、細胞增殖負調控等相關。下調的miRNA預測靶基因與差異基因(上調)交集，GO分析的結果顯示與細胞成分運動的調節、凋亡過程、蛋白質磷酸化、細胞或亞細胞的運動、程序性細胞死亡等功能相關，見表3。

表1 上、下調差異表達的miRNA在年輕與老年表皮組織中的表達差異

表2 差異基因的功能富集分析(下調基因)

注：18個下調的基因參與的生物學進程。Note. Enrichment biological process analysis of 18 down-regulated genes.

注：A：由無監督聚類產生的熱圖，其將樣品分成年輕人和老年人。B：兩個芯片所有基因的火山圖。

注：A：下調的micRNA與基因芯片中上調基因的交集。B：上調的micRNA和基因芯片中下調基因的交集。

2.4 核心基因相互作用和通路富集分析

將共表達的基因使用在線蛋白質相互作用預測軟件(https://string-db.org/)篩選核心基因。隨后，使用DAVID在線分析數據庫對篩選的核心基因進行KEGG通路分析。保留P< 0.05的通路用于PPI作圖。下調miRNA調控靶基因KEGG途徑富集分析結果顯示，該基因主要富集在局灶性粘連、PI3K/AKT信號通路、mTOR信號通路、蛋白質多糖的代謝通路。上調miRNA調控靶基因KEGG途徑富集分析PPAR信號通路、趨化因子信號通路、PI3K/AKT信號通路、色氨酸代謝通路等。

表3 差異基因的功能富集分析(上升基因)

注：11個上調基因參與的生物學進程。Note. Enrichment biological process analysis of 11 up-regulated genes.

注：A：18個下調基因的KEGG通路分析。B：11個上調基因的KEGG通路分析。

3 討論

這些發現表明，microRNA參與了人類表皮衰老的微調。最近的研究結果表明，miRNA作為一種新型基因表達調控因子在銀屑病中發揮重要作用[12]。miRNA的成熟涉及多個步驟，此過程中依次生成兩種中間形式的miRNA，即原代(pri)和前體(前)miRNA。同時，RNase III酶Drosha和配偶雙鏈RNA(dsRNA)結合蛋白Dgcr8切割pri-miRNAs，其被Exportin5識別并隨后從細胞核轉運到細胞質的發夾形前pre-miRNA。另一個RNase III酶Dicer切割pre-miRNA以釋放22nt核苷酸(nt)dsRNA雙鏈體，即具有2nt 3’突出端的miRNA / miRNA雙鏈體。miRNA雙鏈中的一條鏈保存在RISC復合物中，另一條鏈則排出復合物外并迅速降解[13]。關于銀屑病皮膚中異常表達的小ncRNAs(sncRNAs)的研究結果提示sncRNA在牛皮癬中的功能作用[12]，大量實驗結果顯示在皮膚早期發育中占重要部分的miRNA也可以在銀屑病中以關鍵的方式起作用。這與“生命早期出現錯誤可能會在生命后期再次出現錯誤”的理念是一致的。

為了解這些miRNA控制的機制，本課題組同時篩選了不同年齡表皮的mRNA表達譜。在與差異的miRNA預測的基因取交集之后，研究結果顯示上調的miRNA調控的靶基因主要與細胞運動功能的調節、細胞凋亡、蛋白質磷酸化、細胞程序性死亡、有機氮化合物生物合成過程、RNA代謝過程的正調控、信號轉導的正調控、大分子代謝調控等。下調的miRNA調控的靶基因主要與ω羥化酶P450途徑、(NO)生物合成過程、氧化還原酶活性、芳香化酶活性、凋亡過程的正調控、氧結合、細胞增殖負調控等相關。特別值得注意的是上述信號通路往往是腫瘤組織異常激活的通路。上述結果提示衰老與腫瘤的發生發展有共同的信號通路參與。上調miRNA調控靶基因KEGG途徑富集分析結果顯示其主要富集在局灶性粘連、PI3K/AKT信號通路、mTOR信號通路、蛋白質多糖的代謝通路。上調miRNA調控靶基因KEGG途徑富集分析PPAR信號通路、趨化因子信號通路、PI3K/AKT信號通路、色氨酸代謝通路等。值得注意的是，上調與下調miRNA調控的靶基因均對PI3K/AKT信號通路具有調控作用，同時mTOR信號通路、PPAR信號通路、趨化因子信號通路均在腫瘤的發生發展中起重點作用。這在某種程度上解釋了皮膚腫瘤的發生發展病因。

目前在人類表皮衰老領域的miRNA研究較少，二代測序在鑒定miRNA并分析其在皮膚形態發生和體內平衡中的特定功能方面取得了重大進展。此研究從基因水平和miRNA水平多維度確定了參與并調控衰老的潛在原因，所預測的結果為衰老疾病的治療和預測以及皮膚腫瘤疾病發生發展的機制研究提供了理論依據。