RNA-Seq技術篩選APP/PS1阿爾茨海默病模型小鼠差異表達基因及功能分析

史長華，張 玲，陳 巍，付信靖，秦 川

(北京協和醫學院比較醫學中心，中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種老年人中常見的以進行性認知功能障礙和行為損害為特征的神經退行性疾病。AD的病理改變與大腦內老年斑和神經原纖維纏結形成有關。可能的機制包括β淀粉樣肽(amyloid beta，Aβ)沉積、炎癥損傷、氧化應激等。主要累及部位為皮層和海馬。在對118例AD患者神經影像學的觀察中發現，AD患者常出現的妄想，淡漠，抑郁等精神癥狀與前額葉皮層緊密相關[1]。然而目前在AD的研究中，差異基因表達及其功能研究主要集中于全腦或海馬區，尚無前額葉皮層差異分析的系統闡述。RNA深度測序(RNA-Seq)是近年來快速發展的高通量測序技術，具有信噪比高、分辨率高、應用范圍廣等優勢。本研究擬利用APP/PS1雙轉基因動物模型，采用RNA-Seq技術研究AD模型小鼠和野生型小鼠前額葉皮層的基因表達變化，篩選出AD相關特異性的基因，為利用模型小鼠進行AD相關機制和治療研究提供一些思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級雌性APP swe /PS1ΔE9 (PAP)雙轉基因模型小鼠和野生型C57BL/6 J小鼠各5只，9月齡，體重約26～30 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司 [SCXK-(京)2014-0004]，實驗在中國醫學科學院醫學實驗動物研究所開展 [SYXK-(京)2015-0035]。動物實驗方案獲實驗動物使用與管理委員會(IACUC)的批準 [ILAS-QC-2016-001]。

1.2 主要試劑與儀器

Trizol購自美國 Invitrogen 公司；DEPC水購自美國QIAGEN公司；PrimeScript TM RT Master Mix試劑盒購自日本Takara公司；Ethovision XT動物軌跡跟蹤與行為觀察記錄分析系統購自荷蘭Noldus公司；UltraSYBR mixture(with ROX)購自日本Takara公司。HiSeq 3000測序儀購自美國Illumina公司；引物購自中國Invitrogen公司；Qubit 2.0定量儀購自美國Invitrogen公司；Agilent 2100購自美國Agilent公司；PCR儀購自美國Bio-Rad 公司；ABI stepone熒光定量 PCR儀購自美國Thermo公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 轉基因動物的鑒定

PCR 鑒定小鼠的基因型，針對人APP、PS1 基因合成的hAPP正向引物為： 5’-GACTG ACCACTC GACCAGGTTCTG-3’，反向引物：5’-CTTGTAAG TTGGATTCTCATATCCG-3’，產物長度 344 bp；hPS1 正向引物為：5’-AATAGAGAACGGCAGGAGCA-3’，反向引物：5’-GCCATGAGGGCACTAATCAT-3’，產物長度608 bp。

1.3.2 Morris水迷宮實驗

參照文獻[2]用Morris水迷宮實驗檢測AD模型和野生型小鼠的空間學習記憶能力。Morris水迷宮隱藏平臺實驗中潛伏期數據使用重復測量數據的多因素方差分析進行統計，其余結果采用t檢驗，以P< 0.05 為差異有顯著性。

1.3.3 腦組織總 RNA提取

Trizol法提取前額葉皮層總RNA，分別采用Nanodrop、Qubit 2.0、Agilent 2200檢測RNA樣品的純度、濃度和完整系數(RNA integrity number，RIN)等，以保證使用合格的樣品進行測序。

1.3.4 文庫構建、質檢與測序

提取樣本RNA后，將rRNA去除，并將RNA片段化(平均長度為200 nt左右)，逆轉錄合成cDNA并進行粘性末端修復，cDNA的3’末端加上poly(A)尾并連接測序接頭，利用瓊脂糖凝膠電泳選出大于200 nt的片段進行PCR擴增，從而得到測序用的cDNA文庫。構建好的文庫用Agilent 2100分析儀和ABI StepOne Plus實時PCR系統質檢，質檢選出片段大小為260 bp左右的文庫加入流動槽的各通道中，以Paired-End方式進行測序。

1.3.5 基因組比對及差異表達基因分析

經軟件Tophat2將測序數據比對到小鼠參考基因組GRCm38，此時可得到一個bam文件，記錄了每條reads對應的染色體位置。使用DESeq軟件對基因進行定量分析。采用edgeR軟件(3.12.1)進行表達差異顯著性分析(P< 0.05, |logFC| > 1.0)，并對AD樣本的表達值(RPKM)進行聚類分析。

1.3.6 GO和KEGG分析

利用 DAVID 軟件對差異表達的基因進行GO(Gene Ontology)功能(生物學過程，BP)及KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析通路富集分析，幫助了解差異表基因的功能。統計方法為 Fisher’s exact test，Benjamini 算法校正，以校正后P< 0.05 為差異有顯著性。

1.3.7 qRT-PCR實驗驗證

選取6個關鍵基因進行qRT-PCR驗證，其中包括3個上調基因：Trem2、Lyz2、Ctse，3個下調基因：S100a8、S100a9、Ttr。AD模型小鼠和野生型小鼠前額葉皮層總RNA進行反轉錄，使用UltraSYBR mixture試劑盒進行檢測。以β-actin為參考基因，每個mRNA 的相對表達值通過2-△△Ct計算。差異基因引物序列見表1。

2 結果

2.1 APP swe /PS1 ΔE9(PAP)雙轉基因 AD模型小鼠基因型鑒定

目的基因經PCR擴增后可分別在344 bp和608 bp附近位置出現明顯的兩條條帶，即可確定為攜帶APP/PS1基因的陽性小鼠。如圖1所示，兩條帶即為目的基因片段。

表1 qRT-PCR 引物序列

注：M：Marker，N：陰性對照，P：陽性對照，1～5為陽性小鼠。

2.2 Morris 水迷宮實驗

結果如圖2 A所示，在小鼠水迷宮空間探索階段，AD組相對于野生型小鼠自第三天起尋找平臺所用的潛伏期即開始增加(P< 0.05，第3 ～ 6天)；如圖2B，2C所示，AD模型小鼠在水迷宮空間探索的穿越平臺象限和穿越平臺次數有明顯下降(P< 0.05)。

2.3 總RNA質量檢測

AD模型小鼠組與對照組前額葉皮層組織信息見表2。腦組織RNA濃度符合測序要求(≥350 ng/μL)(表2)。結果顯示，所有RNA樣品的RIN值均在7.1～8.6之間，證明這些RNA樣品純度和完整性可用于后續的文庫構建及測序。

2.4 差異表達基因

在AD模型小鼠與野生型小鼠之間發現224個差異基因(P< 0.05, |logFC| > 1.0)，其中205個基因上調，19個基因下調。前20個差異表達基因見表3。繪制火山圖(圖3 A)以展示差異顯著性基因的整體分布情況。使用層次聚類對樣本的表達值RPKM進行聚類分析(圖3B)。

2.5 GO 功能富集分析、KEGG 通路富集分析

為了揭示差異表達基因在AD模型小鼠中參與的生物學過程，對差異基因集進行GO功能富集分析、KEGG 通路富集分析。差異表達基因GO富集的生物過程(圖4A)主要有免疫反應、炎癥反應等，富集的分子功能(圖4B)主要包括細胞膜、粗面內質網等，富集的細胞成分(圖4C)主要包括趨化因子活動以及IgG結合等。KEGG 富集分析結果(圖4D)顯示差異基因參與了吞噬、溶酶體、Toll樣受體信號通路、細胞因子受體相互作用、NOD樣受體信號通路、朊蛋白病、NF-κB信號通路等。

注：A：隱藏平臺實驗中小鼠尋找平臺所用的潛伏期；B和C分別是空間探索實驗中小鼠穿越平臺象限及平臺的次數； *P< 0.05。

樣本號CaseID濃度(ng/μL)Concentration OD260/OD280OD260/OD230RIN28S/18SCon-1494.291.862.427.51.7Con-2706.471.92.157.61.4Con-3331.071.912.037.82.1Con-4586.621.82.168.61.8Con-5455.041.892.397.31.9AD-1697.791.911.837.22.2AD-2457.341.892.337.41.2AD-3619.531.881.678.22AD-4452.661.862.397.11.7AD-5802.961.92.178.61.4

注：Con-1～Con-5是野生型小鼠的前額葉皮層組織，AD-1～AD-5是AD模型小鼠前額葉皮層組織，每組各5例，RNA指控標準是：RIN ≥ 6.5，28S/18S > 0.8和260/280 > 1.8。Note: Con-1-Con-5 present five prefrontal cortex tissues of wide mice, AD-1-AD-5 present five prefrontal cortex tissues of AD mice, The standard for RNA allegations is: RIN ≥ 6.5, 28S/18S > 0.8 and 260/280 > 1.8.

注：A：橫坐標表示基因在不同樣本中的表達倍數變化 (log 2 fold change)，縱坐標表示表達差異的顯著性水平 (-log 10 P-value)，紅色表示差異基因；B：熱圖中紅色表示高表達，綠色表示低表達。

注：A：生物過程；B：分子功能；C：細胞組成；D：KEGG富集分析。

表3 AD模型小鼠與對照組比較的差異基因

2.6 實時熒光定量 PCR 對結果進行驗證

根據嗜神經相關差異基因篩選結果和文獻復習，選取6 個關鍵基因進行qRT-PCR 驗證，其中包括3個上調基因：Trem2、Lyz2、Ctse，3個下調基因：S100a8、S100a9、Ttr。qRT-PCR結果顯示6個關鍵基因上、下調趨勢與RNA-Seq結果(圖5)相一致。

3 討論

圖5 差異基因的RNA-Seq結果以及qRT-PCR 的驗證結果

在目前AD的研究過程中，APP /PS1雙轉基因小鼠是最常用的動物模型，本實驗所采用的APP /PS1雙轉轉基因小鼠由本所遺傳中心構建培育。該模型以C57BL/6 J小鼠為背景，含有人APP swedish 突變位點(K595 N/M596 L)和人PS1ΔE9突變位點，其在3月齡出現學習和記憶缺陷，4.5月齡開始出現老年斑[3]，9～12月齡出現大量老年斑[4-5]，具有和AD患者相似的病理表型，本研究中AD模型小鼠較對照組小鼠空間學習記憶能力下降。該過程涉及多種基因及其產物之間的相互作用、多種信號通路相互調節和拮抗[6-7]，故在整體水平上研究AD模型小鼠基因轉錄的情況及轉錄調控規律十分必要。隨著高通量技術的快速發展，RNA-Seq 技術日趨成熟。該技術對特定組織或細胞在某個時期轉錄出來的所有mRNA進行測序，可研究已知基因并能發現新基因，并可在不同的疾病狀態、不同的環境條件下對以前未檢測到的變化提供可見性。本研究針對AD模型小鼠和野生型小鼠前額葉皮層組織中基因表達水平變化，對差異表達基因進行功能分析；在這些差異的基因中選取3個上調的基因(Trem 2[8]，Lyz 2[9]和Ctse[10])和3個下調的差異基因(Tlr[11]，s100a8和s 100a9[12])，這6個基因在AD相關研究中均有異常表達，采用 qRT-PCR做驗證，結果顯示，這些差異基因與測序結果表達一致，說明該技術重復性較好、可信度高。

本研究共發現224條差異表達基因，對差異表達基因進行GO功能和KEGG富集分析結果表明：差異表達基因主要參與了免疫反應和炎癥反應、toll樣受體信號通路和細胞因子受體相互作用等重要生物學通路。免疫反應相關的差異基因有Toll樣受體2(toll-like receptor 2, TLR2)、Tlr、App、髓細胞激活受體2 (triggering receptor expressed on myeloid cells 2, TREM2)等。Trem2基因在人類位于6p21.1，在小鼠存在于17號染色體，在多種髓系來源的細胞如樹突狀細胞，破骨細胞，組織巨噬細胞廣泛表達[8]。有證據表明，過表達AD小鼠TREM2水平可改善小鼠認知功能[13]，敲除TREM2基因出現明顯的Aβ沉積和小膠質細胞功能障礙[14]，從而加重小鼠的認知損害。總之，TREM2對小膠質細胞發揮抗炎、吞噬和清除凋亡神經元以及Aβ具有重要作用。本研究中，AD小鼠模型前額葉皮層組織TREM2基因表達上調，可能提示其表達水平的增加是一種抵御過度沉積Aβ的良性代償反應。本研究中AD腦中Tlr表達顯著增多，Tlr活化后可激活NF-kB，促進各種炎性細胞因子的產生。伴隨炎性因子及氧自由基的產生[11]，致使炎性因子及氧自由基堆積，可損傷蛋白質、DNA和脂質過氧化物等生物大分子，引起神經細胞發生凋亡，加重AD的損傷作用。當然，上述基因的差異表達是否參與AD相關的免疫炎癥反應，toll樣信號通路還需要作進一步深入研究。

綜上所述，本研究通過RNA-Seq得到了AD模型小鼠前額葉皮層組織中高度相關差異基因，為闡明AD的發病機制提供了重要實驗依據。