腎結石兩種造模方式血、尿生化的動態比對研究

郝志強，王勤章，倪 釗，錢 成，申茂磊，錢 彪

(石河子大學醫學院第一附屬醫院，石河子 832000)

泌尿系任何部位均可發生結石但最常始發于腎，腎結石在形成時多位于腎盂或腎盞，腎臟內晶體和有機物質的大量異常累積，最終導致腎結石發病。結石中90%含有鈣，其中草酸鈣結石最常見。目前對于腎結石的研究最常用的是乙二醇實驗動物模型，在本課題前期研究中發現納米細菌Nanobacteria,NB)是結石的原因之一，并且成功利用納米細菌建立了動物模型[1]，為評價納米細菌的成石效能，現將兩種模型成石過程中血、尿生化做一個動態研究，旨在為腎結石病因學的研究提供數據支持。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取6周齡左右，體重(200±20) g，Wistar雄性大鼠60只，實驗動物均是來源于新疆醫科大學實驗動物中心的SPF級雄性大鼠。合格證號[SCXK(新)2013-0001]；新醫動字[SYXK(新)2010-0003];福利倫理審查證號 [2016]院倫審動實字(001)號(NO)A2016-001。把60只大鼠按隨機數表法分為納米細菌組(NB組，30只)和乙二醇組(EG組，30只)，兩組大鼠均先于新疆地方與民族高發病教育部重點實驗室適應性飼養1周，標準飼料喂養，飼料購自石河子大學實驗動物中心。

1.2 實驗試劑與儀器

電子天平(LT1000B，江蘇常熟市大量儀器有限責任公司)，全自動生化分析儀(Modual DPP，德國羅氏)，多功能光學顯微鏡及圖像采集系統(BX40，日本Olympus)，透射電鏡(JEOL-1230 Electronics，日本JEOL)。

納米細菌懸濁液(自制)、0.9%生理鹽水(山東科倫藥業有限公司)、1.25%乙二醇(天津永晟精細化工有限公司)飲水、1%氯化銨(天津永晟精細化工有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 納米細菌的制備

納米細菌來源于腎結石患者清潔中段晨尿，收集標本后提取并培養，具體操作如下：收集標本5 mL，生理鹽水稀釋2倍后濾器過濾、離心取管底液1 mL，加入DMEM及熱滅活胎牛血清培養，5%CO2,37℃, 28～30 d換液1次，培養6～8周，每30 d換液1次。篩選出無污染的標本制成NB懸液。

1.3.2 模型的建立及標本采集

將60只大鼠隨機分為納米細菌組(NB組，尾靜脈注射1.2 mL NB懸液，30只)和乙二醇組(EG組，1.25%乙二醇飲水+1%氯化銨2 mL/d灌胃，灌胃持續時間為2 w，30只)，實驗周期為10 w，每周每組各處死大鼠3只，處死前采集大鼠血、尿標本，供生化分析，并取兩側鮮活腎臟標本，供病理結晶情況檢測及腎體比(腎臟重量/體重×100%)的計算。

1.3.3 記錄大鼠一般情況

連續觀察10 w內各組大鼠飲食飲水、行為活動等情況，并實時測量記錄其體重變化。

1.3.4 病理組織學檢查

肉眼觀察腎臟的顏色及其大小改變。將標本經固定、脫水透明、浸蠟包埋、切片貼片、脫蠟染色、脫水透明、封固等步驟，制成石蠟病理切片，常規HE染色，在光學顯微鏡下觀察結晶的形成情況,按文獻提供的腎臟結晶分級判定標準[1]，0級記為陰性，I-IV級記為陽性，進行綜合、統計。

1.3.5 生化指標

使用全自動生化分析儀檢測肌酐，尿素，尿酸，尿鈣，血鈣，血鎂，血磷等生化指標，進行統計分析。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠的一般情況

第1～2周，兩組大鼠均表現無異，飲食飲水良好，且性情安靜溫順；自第3周開始，兩組大鼠逐步出現差異，第3～8周，相較于NB組而言，EG組大鼠在性情及活動度等方面表現更為強烈，后者活動度明顯升高且變得煩躁不安；第9～10周，兩組大鼠在飲食飲水、精神狀態、活動度等方面均有不同程度下降。相比而言，NB組大鼠食欲減低，活動減少，精神倦怠，而EG組在此基礎上，更加表現出針刺反應遲鈍等反應。且在造模期間，清理EG組大鼠墊料時，可見明顯血尿痕跡，并有2只大鼠意外死亡。

2.2 腎臟標本觀察

連續性觀察10周內兩組大鼠腎臟大體標本，肉眼可見，第1～2周兩組大鼠均無明顯改變，腎臟表面光滑，腎皮質剖面為暗紅色，髓質呈灰白色，腎門處可見腎乳頭、腎盞、腎盂等正常結構；自第3周開始，乙二醇組較納米細菌組大鼠腎臟略有增大，腎皮質剖面呈紅褐色，髓質呈橘黃色，皮髓結構清晰，腎盞及腎孟良好。第6周以后納米細菌組部分腎臟皮髓結構尚清晰，但有少量散在淡黃色顆粒沉積在腎組織中，觸之有沙礫感。乙二醇組大鼠腎臟腫大，顏色變淺或發白，剖面呈淡黃色，皮髓結構不清晰，可見淡黃色顆粒沉積在皮髓交界處，觸之有沙粒樣感覺，在解剖顯微鏡下，晶體以腎盂為中心呈扇形分布。稱重計算其腎體比結果顯示，差異無顯著性。(表1)

2.3 光學顯微鏡觀察

顯微鏡下可見：納米細菌組大鼠自第4周起，其腎臟病理切片可見灰白色晶體，10周計數，納米細菌組大鼠腎臟晶體陽性11只(陽性率52.4%)，自第3周起，乙二醇組大鼠腎臟切片可見明亮晶體，主要分布于遠曲小管，近曲小管及部分腎小球周圍，形態不規則，晶體多呈零星散在分布，少量晶體互相連接成片成團。兩組數據運用Fisher確切概率法計算其統計學意義，結果顯示P≈0.889，差異無顯著性。(因NB組大鼠在第4周開始成石，EG組大鼠在第3周開始成石，而前幾周已處死的大鼠也存在成石的可能，所以在計算成石率時將之前已處死的大鼠排除在大鼠總計數之外)(表2)

2.4 血液生化分析比對

采集大鼠血液標本進行檢測，結果顯示：1～10周內，納米細菌組與乙二醇組在血鈣、血鎂、血磷、肌酐、尿酸、尿素等六個層面，均顯示二者差異不顯著(P> 0.05)。(表3)

2.5 尿液成分分析比較

收集兩組大鼠尿液標本進行檢測分析得：對1～10周內，納米細菌組與乙二醇組的尿鈣、尿pH、尿比重、24 h尿量等四個方面進行統計學分析，結果顯示，兩組差異無顯著性(P>0.05)。(表4)

3 討論

腎結石是泌尿外科的常見病，容易復發，有資料顯示，經體外沖擊波碎石技術治療后的泌尿系結石患者的結石復發率隨著時間增長而有所升高，其中第1年復發率為6.7%，至第5年復發率則增長到41.8%[2]。未解決這一問題，本課題組積極探尋一種與腎結石形成過程相似的方式，改進造模手段，旨在為腎結石病因學的研究尋求突破。

腎結石主要類型為草酸鈣結石[3]，究其原因，系體內草酸代謝紊亂所致[4]。以往的研究，大都通過乙二醇構建動物疾病模型[5]。乙二醇為草酸代謝通路的中間產物，亦是草酸的前體[6-7]。因此，攝入乙二醇可導致動物體內草酸增加而形成草酸鈣[8]，從而成功構建Wistar雄性大鼠腎結石模型。

表1 納米細菌組與乙二醇組腎體比比較

注：與乙二醇組比較，腎體比差異無顯著性。Note. Compared with ethylene glycol group, there was no significant difference.

表2 納米細菌組與乙二醇組病理結晶情況(%)

注：與乙二醇組比較，病理結晶情況差異無顯著性。Note. Compared with ethylene glycol group, there was no significant difference.

表3 納米細菌組與乙二醇組血液生化分析(n=60)

注：與乙二醇組比較，差異無顯著性。Note. Compared with ethylene glycol group, there was no significant differences.

表4 納米細菌組與乙二醇組尿液生化分析(n=60)

注：與乙二醇組比較，差異無顯著性。Note. Compared with ethylene glycol group, there was no significant differences.

近年來，納米細菌在機體鈣化性疾病中的作用逐漸凸現出來，據資料顯示，NB是體內唯一可以產生羥基磷灰石的生物[9]，在泌尿系結石的發生發展過程中扮演著重要角色[10]，NB所特有的生物礦化功能在臨床許多鈣化性疾病中都得到了有效驗證[11]。NB作為鈣化的核心[12-13]，進一步促進了鈣化的發展。NB在吸引并聚集的同時，還能夠侵入并破壞腎集合管的腎乳頭細胞和腎小管上皮細胞[14]，形成結晶核心，這種晶體核心作為常見的結石前體[15]，最終誘發結石形成。

本研究同時構建了兩種Wistar大鼠腎結石模型，最終兩種方法都成功使大鼠形成腎結石。檢測兩組大鼠的成石率、血、尿生化，顯示二者差異無顯著性，兩種造模方式均可應用于腎結石的研究。但納米細菌來源于腎結石本身，這一造模方式與腎結石形成更加相似，更有利于腎結石成因的研究。另外兩種造模方式各項指標的統計學檢驗，表明NB造模得以實施。從血、尿生化等各項指標來看，NB成石效能有一定意義。

造模期間觀察兩組大鼠一般情況，NB組大鼠食欲減低，活動減少，精神倦怠，而EG組在此基礎上，發生針刺反應遲鈍等反應。且在造模期間，清理EG組大鼠墊料時，可見明顯血尿痕跡，并有2只大鼠意外死亡。表明傳統的乙二醇造模方式，對大鼠機能的損害更為嚴重，納米細菌造模稍加溫和。

對實驗結果，包括腎體比、病理結晶數、血液生化、尿液生化等諸多指標進行統計學分析，結果顯示，上述指標之中，兩組差異均無顯著性，在造模的完成度上，二者沒有差異，均可以達到理想狀態，并成功構建Wistar雄性大鼠腎結石模型。提示改良的造模方式是有意義的。

綜上所述，納米細菌作為腎結石的成因之一，可通過其自身的礦化反應，影響草酸鈣代謝，形成結石。

致謝：

本文研究得到了錢彪副教授的大力支持，同時感謝石河子大學醫學院第一附屬醫院、新疆地方與民族高發病教育部重點實驗室的眾多幫助，在此謹致真誠謝意。