microRNA-494通過TLR-4通路抑制成骨細胞分化及基質礦化的分子機制

匡嘉兵，徐 昊，張克良，沈 波，許閆嚴

(武漢市普愛醫院暨華中科技大學同濟醫學院附屬普愛醫院，西院骨一科，武漢 430030)

microRNAs(miRNAs)是一類長度約為22個核苷酸、保守、進化的非編碼單鏈RNA小分子[1]。miRNA存在于果蠅、小鼠、人類和植物等基因組中，均為內源性表達[2]。研究已經證實，miRNAs在多數腫瘤中表達失調，包括結直腸癌、淋巴瘤、乳腺癌、肝細胞癌等[3]。此外，研究發現miR-494會參與腦缺血、神經變性病、多發性硬化、腦腫瘤以及脊髓病變等多種生理疾病中[4-6]。骨質疏松癥是世界上常見的病癥，發病率極高。成骨細胞在骨代謝中起著重要的作用，參與骨吸收和骨重建的過程[7]。當機體的骨吸收大于骨重建時，就會表現出骨量減少、骨流失以及骨顯微結構被破壞的現象[8]。成骨細胞是骨代謝的主要功能細胞，細胞的增殖和分化能力決定著最終的成骨量[9]。Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)廣泛存在于人類和動物的多種細胞中，屬于I型跨膜蛋白，參與機體的初級免疫過程，并調節機體的多種生理功能，例如骨細胞的代謝和干細胞的增殖等[10]。此外，TLR介導的炎癥因子的分泌對早期的骨修復起著重要的作用。人的TLR共分為5個亞科、10個亞型。成骨細胞表面主要表達TLR-3和TLR-4[11]。本研究即探討TLR-4受體在成骨細胞分化及基質礦化的可能分子機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

小鼠成骨細胞株 MC3T3-E1購自于中國科學院上海細胞庫，DMEM培養基、胰酶、胎牛血清和青鏈霉素雙抗均購自于美國Gibco公司。四甲基偶氮唑藍(MTT)、β-甘油磷酸鈉和TritonX-100均購于自美國Sigma公司。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天生物科技有限公司。Von Kossa染色試劑盒購自于湖北百奧斯生物技術有限公司。TLR-4抗體、β-actin抗體、辣根酶標記山羊抗小鼠抗體購自于美國CST公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 miR-494 mimic轉染小鼠成骨細胞株MC3T3-E1

miR-494 mimic及其陰性對照均購自于銳博生物科技有限公司。使用含10%血清的DMEM培養基培養小鼠成骨細胞株MC3T3-E1，在37℃，5% CO2培養箱中培養。將MC3T3-E1細胞分為miR-494 mimic轉染組和陰性對照組。miR-494 mimic轉染組：向培養中加入化學合成的miR-494 mimic和脂質體；陰性對照組：向培養液中加入無義序列miR-494 mimic和脂質體。

1.2.2 qRT-PCR檢測miR-494在小鼠成骨細胞株MC3T3-E1中的表達

采用Trizol提取法提取細胞中的總RNA，按照Micro RNA 反轉錄試劑盒說明書對總RNA進行反轉錄。反轉錄體系為20 μL：1 μL總RNA，4 μL 5×Reaction Mix，2 μL 10×Super Script Enzyme Mix，加入雙蒸水將體系補足至20 μL，混勻后離心。反應條件為：37℃60 min，95℃5 min，置于4℃保存備用。按照qRT-PCR試劑盒說明書進行轉錄擴增，反應體系為20 μL。使用SYBR Green染料法進行測定，每個樣本設置4個復孔。按照試劑盒說明書的反應條件進行擴增。miR-494的相對表達量用2-△△CT法進行計算。

1.2.3 MTT法檢測小鼠成骨細胞株MC3T3-E1轉染前后的增殖活性

將小鼠成骨細胞株MC3T3-E1調整至適宜濃度后，接種于96孔板。實驗分為陰性對照組和miR-494 mimic轉染組，每組設置6個復孔。孵育細胞48 h，實驗重復 3 次。培養結束后，每孔加入20 μLMTT溶液，培養4 h，棄上清液，加入150 μL DMSO，37℃下振蕩10 min，使用酶標儀測定570 nm處測定吸光度值。

1.2.4 小鼠成骨細胞株MC3T3-E1轉染前后ALP活性的測定

陰性對照組和miR-494 mimic轉染組的細胞培養結束后，將細胞經胰酶消化后轉移至離心管，使用PBS溶液反復凍融細胞后，按照ALP測定試劑盒說明書操作，用來評價小鼠成骨細胞的分化能力。

1.2.5 小鼠成骨細胞株MC3T3-E1轉染前后骨鈣素(osteocalcin，OC)活性的測定

將小鼠成骨細胞株MC3T3-E1接種于96孔板，分組同上。培養4 d后，使用骨鈣素放射免疫分析試劑盒測定小鼠成骨細胞株MC3T3-E1中骨鈣素的活力。

1.2.6 小鼠成骨細胞株MC3T3-E1轉染前后礦化結節數的測定

本實驗采用Vonkossa鈣化染色法測定小鼠成骨細胞株MC3T3-E1轉染前后的礦化結節數。將小鼠成骨細胞株MC3T3-E1接種于96孔板，分組同上。培養18 d后，使用Vonkossa鈣化液對細胞進行換液，之后采用Vonkossa鈣化染色法對細胞進行染色。各樣本的礦化結節形成情況使用HPIAS-100高清晰度彩色病理圖文報告分析系統計算。

1.2.7 Western blot檢測轉染前后TLR-4蛋白的表達差異

將小鼠成骨細胞株MC3T3-E1接種于6孔板，分組同上。培養結束后，棄去培養液，用裂解液充分裂解細胞后，離心取上清液。使用BCA蛋白濃度試劑盒對提取的總蛋白進行定量。使用上樣緩沖液，在沸水浴中使蛋白變性。SDS-PAGE凝膠電泳選取5%的濃縮膠和10%的分離膠，在150 Ma下轉膜3 h，使用5%的脫脂奶粉封閉2 h。分別使用TLR-4抗體(1∶1000)和β-actin(1∶500)4℃下孵育過夜。使用二抗(1∶5000)在室溫下孵育2 h。使用灰度值軟件對蛋白條帶進行定量計算。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 qRT-PCR檢測miR-494在小鼠成骨細胞株MC3T3-E1中的表達

如表1所示，qRT-PCR結果顯示miR-494在小鼠成骨細胞株MC3T3-E1中的表達量極顯著的低于miR-494 mimic轉染組(P<0.05)，說明miR-494 mimic轉染小鼠成骨細胞株MC3T3-E1成功，使miR-494在小鼠成骨細胞株MC3T3-E1中過表達。

表1 miR-494在小鼠成骨細胞株MC3T3-E1中的表達(n=16)

注：與陰性對照組相比，*P<0.05。Note. Compared with negative control group,*P<0.05.

2.2 MTT法檢測小鼠成骨細胞株MC3T3-E1轉染前后的增殖活性

本實驗對miR-494 mimic轉染小鼠成骨細胞株MC3T3-E1后，MTT法檢測轉染0 h、48 h后細胞增殖率的變化。如表2所示，miR-494 mimic轉染組的細胞增殖率較陰性對照組顯著降低(P<0.05)，證實miR-494抑制小鼠成骨細胞株MC3T3-E1的增殖。

2.3 小鼠成骨細胞株MC3T3-E1轉染前后ALP活性的測定

本實驗檢測了小鼠成骨細胞株MC3T3-E1轉染前后ALP的活性。結果如表3所示，與陰性對照組相比，miR-494 mimic轉染小鼠成骨細胞株MC3T3-E1后，細胞中ALP的活性顯著受到抑制(P<0.05)。這說明miR-494會使小鼠成骨細胞株MC3T3-E1中的ALP活力降低。

2.4 小鼠成骨細胞株MC3T3-E1轉染前后骨鈣素(OC)活性的測定

在成骨細胞分化中期，骨鈣素的含量會上升。本實驗測定了miR-494 mimic轉染后，小鼠成骨細胞株MC3T3-E1中骨鈣素的含量。結果如表4所示，與陰性對照組相比，miR-494 mimic轉染小鼠成骨細胞株MC3T3-E1后，細胞中OC的活性顯著受到抑制(P<0.05)。這說明miR-494會使小鼠成骨細胞株MC3T3-E1中的OC活力降低。

2.5 小鼠成骨細胞株MC3T3-E1轉染前后礦化結節數的測定

礦化結節是成骨細胞晚期分化的重要標志。因此，本實驗通過檢測小鼠成骨細胞株MC3T3-E1中礦化結節的數目，反映miR-494對成骨細胞晚期分化的程度。結果如表5所示，陰性對照組中的成骨細胞形成了圓形礦化結節，且邊界清晰。miR-494 mimic轉染組細胞形成的礦化結節數顯著低于陰性對照組(P<0.05)。說明miR-494會抑制成骨細胞形成礦化結節。

2.6 小鼠成骨細胞株MC3T3-E1轉染前后TLR-4蛋白的表達差異

本實驗測定了miR-494 mimic轉染細胞后，細胞中TLR-4蛋白的表達差異。結果如表6所示，Western blot檢測結果表明，與陰性對照組相比，miR-494 mimic轉染組細胞中TLR-4蛋白表達量顯著升高(P<0.05)。說明miR-494會增加小鼠成骨細胞株MC3T3-E1中TLR-4蛋白的表達量，即miR-494可能通過TLR-4通路抑制成骨細胞分化及基質礦化。

表2 小鼠成骨細胞株MC3T3-E1轉染前后的增殖率(n=16，%)

注：與陰性對照組培養0 h相比，*P<0.05；與陰性對照組培養48 h相比，#P<0.05。Note. Compared with negative control group (Incubation time 0 h),*P<0.05. Compared with negative control group (Incubation time was 48 h),#P<0.05.

表3 小鼠成骨細胞株MC3T3-E1轉染前后ALP活性(n=16)

注：與陰性對照組相比，*P<0.05。Note. Compared with negative control group,*P<0.05.

表4 小鼠成骨細胞株MC3T3-E1轉染前后OC活性(n=16)

注：與陰性對照組相比，*P<0.05。Note. Compared with negative control group,*P<0.05.

表5 小鼠成骨細胞礦化結節形成情況比較(n=16)

注：與陰性對照組相比，*P<0.05。Note. Compared with negative control group,*P<0.05.

表6 小鼠成骨細胞TLR-4蛋白的表達差異(n=16)

注：與陰性對照組相比，*P<0.05。Note. Compared with negative control group,*P<0.05.

3 討論

骨質疏松是臨床常見的骨科疾病，會出現骨骼密度降低、脆性增加、骨折或腰背疼痛等現象[12]。骨骼的礦化是維持人體骨骼正常狀態的關鍵，這一過程主要由成熟的成骨細胞分泌細胞外基質，與體內的無機鹽共同完成，從而實現骨骼的正常代謝[13]。因此，起源于骨髓基質間質細胞的成骨細胞，主要參與增殖、分化以及基質鈣化[14]。MC3T3-E1來源于C57BL/6小鼠的顱蓋骨細胞，具有成骨細胞的生物學特性，因此作為成骨細胞研究中的體外模型[15]。

在本研究中，miR-494 mimic轉染結果顯示，與陰性對照組相比，小鼠成骨細胞株MC3T3-E1轉染后的miR-494的mRNA的表達量顯著升高，說明miR-494 mimic轉染小鼠成骨細胞株MC3T3-E1，成功使miR-494過表達。MTT法檢測結果表明：miR-494 mimic轉染組的細胞增殖率較陰性對照組顯著降低，證實miR-494抑制小鼠成骨細胞株MC3T3-E1的增殖。

ALP是成骨細胞膜上所分泌的一種鈣結合轉運蛋白，能夠促進細胞的成熟和鈣化[16]。ALP在細胞內的表達量可以作為衡量成骨細胞分化程度的指標，應用十分廣泛。ALP的活性會隨著成骨細胞不斷成熟而呈上升趨勢，當骨細胞的增殖和分化受到抑制時，成骨細胞的礦化作用受阻，ALP的活性降低[17]。在本實驗中，miR-494 mimic轉染組細胞中的ALP活性顯著低于陰性對照組，說明miR-494會使小鼠成骨細胞株MC3T3-E1的早期分化能力降低。骨鈣素是維持骨組織正常鈣化的必需因子，ALP和骨鈣素(OC)分別是成骨細胞分化早期和分化中期的標志物[18]。本實驗結果表明，與陰性對照組相比，miR-494 mimic轉染組MC3T3-E1細胞中骨鈣素的活力顯著降低。上述結果提示miR-494具有抑制成骨細胞MC3T3-E1中期分化的作用。

礦化結節是衡量骨細胞晚期分化程度的指標，是成骨細胞分化成熟的階段，是成骨功能的形態表現[19]。Von Kossa鈣化染色法的原理是：將礦化基質中的碳酸鹽和磷酸鹽轉化為碳酸銀和磷酸銀，然后將銀離子還原成銀后進行測定。Von Kossa鈣化染色法可以通過礦化結節的數目，反映成骨細胞的鈣化程度。本實驗證實，與陰性對照組相比，miR-494 mimic轉染組MC3T3-E1細胞中礦化結節的數目顯著降低。說明miR-494會抑制MC3T3-E1細胞的礦化。

TLR-4是細胞膜上一種重要的跨膜受體，不僅參與機體內細胞的增殖、分化及凋亡，還參與骨代謝功能的調控[20]。研究證實，TLR-4受體上調會抑制骨細胞的增殖和分化。在成骨細胞中，TLR-4通路是參與調控細胞增殖和分化的重要通路之一[21-22]。因此，本研究通過Western blot檢測了小鼠成骨細胞中TLR-4的蛋白表達，初步探討miR-494對成骨細胞的潛在作用機制。結果表明，miR-494可上調成骨細胞中TLR-4的蛋白表達，該作用可能是miR-494抑制成骨細胞增殖和分化的潛在機制。

綜上所述，miR-494能夠通過TLR-4通路抑制小鼠成骨細胞株MC3T3-E1的增殖活力，降低細胞中ALP、OC的活力，減少成骨細胞中的礦化結節數，抑制成骨細胞分化及基質礦化。