長鏈非編碼RNA在肺纖維化中作用機制的研究進展

周俊海，黃瑞雪

（中南大學湘雅公共衛生學院勞動衛生與環境衛生學系，湖南長沙 410078）

肺纖維化是以成纖維細胞增殖及大量細胞外基質沉積并伴炎癥損傷、組織結構破壞為特征的一大類肺疾病的終末期改變。石棉、礦物粉塵、藥物和放射損傷等多種因素均可導致肺纖維化［1］。針對肺纖維化，現有措施主要是重在預防和改善肺功能，治療上尚無有效特異性藥物使用對策，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA），長度＞200核苷酸，缺少開放閱讀框，不編碼蛋白質。研究發現，其在轉錄及轉錄后等多個層次發揮作用，調控基因的表達。近年來，關于lncRNA在肺纖維化中作用機制的研究逐漸增多［2］。為了進一步了解其在肺纖維化中的功能意義，為肺纖維化的預防及治療提供參考，本文從lncRNA的角度出發，綜述其在肺纖維化發生發展過程中的作用機制。

1 lncRNA參與肺纖維化的調控

上皮細胞間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細胞通過特定程序轉化為具有間充質表型細胞的生物學過程，是肺纖維化發病機制中的重要進程。EMT發生時，肺泡上皮細胞受損，細胞失去極性，細胞原有的標志物丟失或下調表達，而間充質細胞標志物增多，導致細胞黏附能力減弱，細胞遷移性增加，細胞形態也發生改變，最終出現纖維化改變。目前EMT的發生機制比較清楚的是，在肺泡上皮細胞中，轉化生長因子β1（transforming growing factor-β1，TGF-β1）通過激活果蠅母系抗頭狀蛋白（drosophilamothers against decapentaplegic protein，Smad）通路促進EMT過程。近年來，針對肺纖維化的表觀遺傳調控研究揭示了lncRNA在EMT過程中發揮重要作用。研究證實，lncRNA主要通過以下三種方式參與調控EMT進程：一是lncRNA在轉錄水平調控EMT相關基因和蛋白的表達；二是lncRNA參與EMT相關信號通路；三是lncRNA通過競爭性內源機制與miR?NA競爭性結合，從而影響miRNA下游與EMT相關基因的表達。

lncRNA在轉錄水平的調控主要是指lncRNA干擾信使RNA（messenger RNA，mRNA）的轉錄以及直接與蛋白結合，影響EMT相關蛋白的表達。Sun等［3］用博來霉素誘導小鼠產生肺纖維化，基因芯片檢測轉錄組表達改變情況，發現博來霉素誘導的小鼠特發性肺纖維化模型中，513條lncRNA表達上調，204條表達下調。基因本體分析（GeneOntology analysis，GO分析）發現這些lncRNA的表達改變與肺泡上皮形態，細胞分化相關聯，信號通路分析（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG分析）發現lncRNA的表達改變與EMT進程密切相關，不僅如此，作者還鑒定出2條lncRNA：uc.77和2700086A05Rik通過調干擾鋅指E盒結合蛋白2（zinc finger E-box binding protein 2，Zeb2）和同源盒基因3（homeobtic gene3，Hoxa3）mRNA的表達而誘導肺上皮細胞產生EMT。He等［4］研究發現，lncRNA FEZF1-AS1在非小細胞肺癌細胞株上表達降低時，能抑制細胞EMT進程。機制研究表明，lncRNA FEZF1-AS1通過直接與組蛋白賴氨酸特異性去甲基酶1和組蛋白-賴氨酸N-甲基轉移酶蛋白結合后抑制EMT的進程。

lncRNA能參與EMT相關信號通路，發揮對EMT的調控作用。Xiang等［5］針對lncRNA肺腺癌轉移相關轉錄因子1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）在EMT中的作用展開了研究，發現TGF-β1誘導血管內皮祖細胞產生EMT的過程中伴隨著lncRNA MALAT1表達增高的現象，lncRNA MALAT1與miR-145結合后，引起下游重組人轉化生長因子β受體2（recom?binant human transforming growth factor beta receptorⅡ，TGFBR2）和SMAD3基因表達改變，激活TGF-β1表達，從而起到促進EMT作用。研究者用二氧化硅染毒小鼠制作出肺纖維化模型，在動物和細胞實驗中發現，lncRNA MALAT1通過競爭性結合miR-503，對下游與EMT進程密切相關的基因蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）、哺乳動物西羅莫司（sirolimos，雷帕霉素）靶蛋白（mammalian target of Rapamycin，mTOR）、鋅指轉錄因子Snail等的表達產生影響，從而促進二氧化硅誘導的肺纖維化發生發展［6］。Yang 等［7］研究了 lncRNA H19 在TGF-β1誘導的牛乳腺上皮細胞（bovine mammary epithelial cells，MAC-T）EMT中的作用，發現其在牛乳房炎癥組織和炎癥性MAC-T細胞中高表達，其通過參與PI3K/AKT信號通路，促進TGF-β1介導的EMT進程。該研究小組還對lncRNA-ATB在EMT中的作用展開了研究，發現M2巨噬細胞分泌的TGF-β1能激活肺上皮細胞中的lncRNA-ATB表達升高，而且后者通過競爭性結合miR-200C對下游EMT相關基因Zeb1起調節作用，從而促進EMT過程［8］。以上信號通路研究說明，多個lncRNA可能參與同一EMT相關信號通路，如lncRNA MALAT1和lncRNA H19均能通過調節PI3K/AKT信號通路促進TGF-β1介導的EMT進程，但不同的lncRNA在同一信號通路中作用機制可能不同，如lncRNA MALAT1存在與miRNA的競爭性內源機制，而lncRNA H19在該研究中未顯示與miRNA存在競爭性內源機制。

lncRNA通過競爭性內源機制與miRNA競爭性結合，從而影響miRNA下游與EMT相關基因的表達是目前EMT表觀調控機制研究的內容。Song等［9］研究了lncRNA MRAK088388和MRAK081523在肺纖維化中的作用機制。結果發現，前者通過競爭性結合miR-29b調控下游。N4bp2表達，而后者通過競爭性結合let-7i-5p調控下游Plxna4表達。作者認為lncRNA在肺纖維化中促進EMT的作用機制與競爭性內源性結合miRNA相關。Liu等［10］運用基因芯片和生物信息學手段分析了TGF-β1誘導的肺上皮細胞EMT中mRNA，miRNA和lncRNA的表達改變情況，及三者的共表達網絡，發現在EMT進程中，三者均出現表達改變，其中24條mRNA、11條miRNA和33條lncRNA能共表達且相互影響，但三者之間不存在競爭性內源機制。作者認為可能的解釋是，生物在進化過程中發展出來很多復雜的機制，而競爭性內源機制學說可能僅起到調節作用而不能解釋三者之間的共表達關系。該實驗雖無發現競爭性內源機制，但在肺纖維化的EMT進程中作用不可忽視，今后需要更多實驗證據支撐lncRNA的競爭性內源機制學說在EMT中所起的作用。

2 lncRNA參與肺纖維化的炎性-免疫反應

肺泡上皮細胞是肺部抵御外界侵害和感染的第一道屏障，主要有2類細胞組成，包括90%的Ⅰ型細胞和10%的Ⅱ型細胞。炎癥-免疫反應是肺纖維化的病理基礎過程。初期肺泡上皮細胞損傷，產生炎癥反應，細胞結構和膜蛋白調節改變，上皮黏附分子異常表達，細胞因子及其他蛋白酶等分泌增多，炎癥和異常修復導致肺間充質細胞增殖，產生大量的膠原和細胞外基質。隨著炎性-免疫反應的進展，免疫系統對外界刺激因素或細胞因子等進行非特異或特異性識別以及清除，肺泡壁、氣道和血管最終發生不可逆的肺部纖維化。從lncRNA的角度深入了解肺炎癥-免疫反應對肺纖維化的貢獻，有助于揭示肺纖維化的部分機制。Dai等［11］采用大鼠肺損傷模型研究lncRNA MALAT1在肺泡上皮細胞損傷中的作用，發現lncRNA MALAT1可激活脂多糖誘導的炎癥反應通路以及促進脂多糖誘導的肺損傷進程，且通過競爭性結合miRNA-146a的機制發揮促進細胞損傷的作用。

lncRNA通過調控炎性相關因子表達參與炎癥反應過程，從而對肺纖維化炎癥發生發展進程產生影響。Wang等［12］運用機械通風誘導的小鼠肺損傷和肺纖維化模型，發現332條lncRNA表達出現改變，GO分析發現，表達改變的lncRNA功能富集在細胞炎癥反應和纖維化上；KEGG分析發現，lncRNA可能通過Wnt、缺氧誘導因子和Toll樣受體等免疫反應通路介導纖維化進程。已知長期吸入香煙煙霧與肺纖維化發病明顯相關，Liu等［13］發現，香煙煙霧誘導人支氣管上皮細胞出現纖維化，lncRNA HOTAIR和炎癥分子白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）表達改變。ChIP實驗證實，lncRNA HOTAIR能直接和轉錄因子結合，阻斷IL-6炎癥因子后，STAT3表達下調，lncRNA HOTAIR過表達，說明肺纖維化中的炎癥因子IL-6能通過STAT3信號通路上調lncRNA HOTAIR的表達，對肺纖維化的發生發展產生作用。Huang等［14］對PM2.5顆粒物引起肺纖維化的機制展開研究，發現PM2.5處理人支氣管上皮細胞后，lncRNA MALAT1表達改變與纖維化進程呈現相關性，lncRNA MALAT1升高的程度與炎癥因子IL-6和IL-8表達升高也呈現一致性，說明lncRNA MALAT1通過調控炎癥因子參與PM2.5誘導的肺纖維化過程。

lncRNA BGas通過調控免疫反應相關蛋白表達，參與肺纖維化免疫反應。Duru等［15］在輻射誘導肺纖維化的綜述中指出，輻射誘導肺纖維化的發生與巨噬細胞極化、免疫調控以及lncRNA之間關系密切。C57B/6小鼠接受輻照后，lncRNA LIRR1和lncRNA LIRR5表達升高，而lncRNA LIRR2，3和4表達降低。進一步針對lncRNA LIRR1展開研究，發現支氣管上皮細胞株BEAS3B經輻照后，lncRNA LIRR1在此細胞株上表達升高，細胞進入G1期的數量增多，DNA修復蛋白如KU抗原和70 ku亞單位（70 ku subunit of KU antigen，KU70）表達下降。結果說明在輻射誘導肺纖維化過程中，lncRNA LIRR1介導輻射后細胞的DNA損傷免疫反應。Balloy等［16］用銅綠色假單胞菌（綠膿桿菌）感染原代囊性纖維化患者的肺上皮細胞和正常人上皮細胞，對比分析2組之間轉錄組情況，發現lncRNA轉錄水平在該菌感染原代囊性纖維化患者的肺上皮細胞中顯著改變，GO分析發現改變表達的lncRNA與囊性纖維化的炎癥反應通路密切相關，其中lncRNA LINC00862和lncRNA CTD-2619J13在上皮細胞感染的0，2，4和6 h均表達上調，可作為囊性纖維化的標志物。Saayman等［17］鑒定發現了一條與囊性纖維化跨膜傳導調節因子（cystic fibrosis trans?membrane conductance regulator，CFTR）有關的lncRNA BGas，發現其過表達時，CFTR功能受抑制，反之，采用siRNA技術沉默lncRNA BGas后，CFTR活性激活。采用生物素標記寡核苷酸實驗發現，lncRNA BGas能與高遷移率族蛋白14多克隆抗體、人高速泳動蛋白17和高遷移率族蛋白B1抗體及重組人良性的神經細胞腫瘤同系物（within BGCN homolog）蛋白等幾種在肺纖維化進程中調節炎癥-免疫反應的蛋白結合，調控這些蛋白的表達。曹國紅等［18］通過觀察博霉素誘導的大鼠肺纖維化模型中lncRNA表達譜的變化，探討lncRNA在肺纖維化中的調控機制。結果發現，表達上調的lncRNA 210個，表達下調358個，GO分析及KEGG分析發現，發生變化的lncRNA在生物學功能上主要涉及免疫反應，參與的信號通路主要有細胞因子與細胞因子受體相互作用、趨化因子信號轉導通路、Janus激酶/信號轉導及轉錄激活因子信號通路和過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路等［19］。

3 lncRNA參與肺纖維化的凋亡過程

細胞凋亡是細胞程序性死亡的方式，與肺纖維化發生發展密切相關。細胞凋亡涉及一系列蛋白的激活、表達以及調控的作用，其中，胱天蛋白酶家族蛋白、Bcl-2家族蛋白、P53蛋白以及某些受體扮演重要角色。常見細胞凋亡通路有線粒體通路、細胞膜通路以及內質網通路。細胞凋亡可刺激這3條通路的任何一條，也可激活多條通路，導致凋亡產生。目前研究發現肺泡上皮細胞凋亡是導致肺纖維化形成的主要原因。細胞凋亡增多直接導致肺泡塌陷，加速肺纖維化進程。

lncRNA通過調控凋亡相關蛋白或通路參與凋亡過程。Gao等［20］對比分析了特發性纖維化患者和正常對照組外周血樣本lncRNA TERRA的表達，發現其在特發性纖維化患者外周血中顯著升高，當其被siRNA干擾沉默后，可改善線粒體相關細胞周期E基因，如基質金屬蛋白酶，Bcl-2家族基因，增強線粒體功能，同時增強凋亡相關蛋白的表達，如細胞色素c、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3等。研究表明，lncRNA TERRA通過調節凋亡蛋白以及調控線粒體功能，從而對纖維化發生發展產生作用。Du等［21］研究對比分析24例特發性肺纖維化和配對24例正常人外周血中lncRNA的表達差異譜，發現440個lncRNA上調，1376個lncRNA下調。生物信息學發現，其中1個lncRNA CDKN2B-AS1的表達下調能激活P53信號通路，促進肺癌的發生，說明在特發性肺纖維化患者中，肺癌的發生與lncRNA表達改變以及參與P53信號通路有關。Zhou等［22］研究了lncRNA-P21在肺纖維化中的作用，發現其低表達能激活HY3和H4在Thy-1啟動子上的乙酰化反應，以及激活Thy-1的活性，從而誘導細胞凋亡增多，促進肺纖維化發生發展。

4 展望

lncRNA雖不編碼蛋白質，但能與同源DNA序列或RNA序列結合，也能折疊成復雜的二級結構，與多種蛋白質結合，參與轉錄前調控，如lncRNA的部分區域與DNA結合，然后其他部分折疊成高級結構，再與表觀因子結合，調控下游基因轉錄。lncRNA還可參與轉錄過程的調控以及轉錄后調控，發揮多種重要生物學功能。綜上所述，在lncRNA與肺纖維化作用機制研究中，lncRNA主要通過某些信號通路或競爭性結合miRNA調控EMT進程、參與纖維化炎癥-免疫反應、調控凋亡相關蛋白或通路參與凋亡過程等發揮影響肺纖維化的發生發展作用。lncRNA在肺纖維化作用機制的研究，為揭示肺纖維化的發病機制提供了新的思路，也為今后肺纖維化的診斷和治療提供的有價值的生物學標志物和治療干預靶點。但外界致肺纖維化因素的刺激、肺效應分子、多個信號通路、細胞因子和蛋白參與，使得lncRNA調控肺纖維化的機制構成了復雜的細胞-分子-通路-蛋白網絡。目前，針對lncRNA在肺纖維化中的研究還處在起始階段，很多機制還尚不清楚，如競爭性內源結合機制具體是如何發揮作用，lncRNA是否能參與內質網通路調控肺纖維化，lncRNA在轉錄前、轉錄中和轉錄后如何調控相關通路和基因。這些問題將引導我們繼續lncRNA的研究，深入探究其在肺纖維化中所起的作用。