3D細胞培養(yǎng)在阿爾茨海默病研究中的應(yīng)用

康美美，王 蓉(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院中心實驗室，北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京腦重大疾病研究院阿爾茨海默病研究所，神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京 100053)

近些年來，由于傳統(tǒng)2D細胞培養(yǎng)和動物模型的局限性，3D細胞培養(yǎng)技術(shù)區(qū)別于二者的優(yōu)勢逐漸得到各國研究學(xué)者的關(guān)注。在腫瘤和藥物高通量篩選方面3D細胞培養(yǎng)模型已經(jīng)取得了初步的成果。但是在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的研究當(dāng)中，此項技術(shù)的應(yīng)用才剛剛開始。本文希望通過介紹3D細胞培養(yǎng)近些年在AD方面的應(yīng)用，給AD研究學(xué)者一些啟發(fā)。

1 細胞培養(yǎng)

1.1 細胞培養(yǎng)簡介

自從1885年德國學(xué)者Willhelm Roux從雞胚中成功分離出細胞以來，組織細胞培養(yǎng)技術(shù)開始萌芽[1]；Harrison[2]和Carrel等[3]分別于1907年和1912年開始研究離體細胞培養(yǎng)方法，現(xiàn)代細胞培養(yǎng)技術(shù)誕生。經(jīng)過一百多年的發(fā)展，細胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、組織工程、再生醫(yī)學(xué)和工業(yè)實踐當(dāng)中。

細胞培養(yǎng)(cell culture)指的是從體內(nèi)組織取出細胞，并為其提供一個無菌、具有適當(dāng)溫度及酸堿度的環(huán)境，給予充分營養(yǎng)，使其生長繁殖并維持其結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。從體內(nèi)取出的細胞進行首次培養(yǎng)的過程稱為原代培養(yǎng)(primary culture)；原代培養(yǎng)的細胞生長到一定程度，受環(huán)境影響，需要轉(zhuǎn)移到另一個新的容器，稱為傳代培養(yǎng)(subculture)。

1.2 傳統(tǒng)2D細胞培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)勢與劣勢

2D細胞培養(yǎng)模型一直是細胞水平的體外研究的主要手段。2D細胞培養(yǎng)是將離體的細胞粘附在塑料培養(yǎng)板或玻璃板上，在添加營養(yǎng)物質(zhì)和細胞因子的培養(yǎng)基中單層培養(yǎng)。因2D細胞培養(yǎng)技術(shù)簡潔及高效的特點，得到了生物學(xué)家和臨床工作者的認同。

然而，2D培養(yǎng)技術(shù)按時傳代的要求限制了細胞的大規(guī)模培養(yǎng)；且因為平板附著的原因，細胞的形態(tài)、細胞內(nèi)部骨架和核形狀發(fā)生改變，進而反過來影響基因和蛋白質(zhì)變化[4]。其次，2D培養(yǎng)技術(shù)的單層細胞結(jié)構(gòu)，使得培養(yǎng)物有時不能準確再現(xiàn)動物的生理或病理過程[5]。

2 三維細胞培養(yǎng)技術(shù)

2.1 3D細胞培養(yǎng)

目前，在體研究主要依賴于構(gòu)建動物模型，細胞水平則主要基于二維培養(yǎng)條件下的實驗研究。然而，經(jīng)歷了100多年的變化之后，研究人員發(fā)現(xiàn)在體外進行二維培養(yǎng)的細胞會逐漸改變甚至喪失其原有的性狀和形態(tài)，結(jié)構(gòu)與功能等方面也與在體環(huán)境不同[6]；動物模型則因為耗時長、操作復(fù)雜以及價格昂貴等因素限制了大規(guī)模開展實驗。由于二維細胞培養(yǎng)模型和動物模型應(yīng)用的局限性，以及其他類似組織工程的相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，三維細胞培養(yǎng)技術(shù)(three-dimensional cell culture，TDCC)應(yīng)運而生。

三維細胞培養(yǎng)不同于二維單層培養(yǎng)的核心是細胞與培養(yǎng)環(huán)境間相互作用，它指將三維結(jié)構(gòu)不同材料的載體與不同種類細胞在體外進行共培養(yǎng)，使細胞在支架上進行空間立體型生長、分化和遷移，并形成具有一定組織特異性的三維復(fù)合結(jié)構(gòu)[7]。三維細胞培養(yǎng)較之二維細胞培養(yǎng)技術(shù)可通過改善胞間交流、作用力及構(gòu)建各種營養(yǎng)因子濃度梯度更大程度地模擬體內(nèi)環(huán)境，使細胞形成類似體內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)，發(fā)揮其功能。此外，三維細胞培養(yǎng)還具有直觀性可控性特點，可以將簡單的體外二維細胞培養(yǎng)技術(shù)與組織器官及生物體聯(lián)系起來，在體內(nèi)體外實驗之間架起一座橋梁[8]。3D細胞培養(yǎng)在腫瘤[9]和藥物篩選[10-11]方面已取得廣泛應(yīng)用，在神經(jīng)退行性疾病方面，3D細胞培養(yǎng)模型的優(yōu)勢也逐漸吸引了各國研究學(xué)者的關(guān)注。

2.2 3D細胞培養(yǎng)技術(shù)支架材料

按照來源不同，可以將支架材料分為天然材料、合成材料及新型復(fù)合材料三大類[12 - 13]。

天然材料指自然界生長或者形成的材料，大部分為細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)[14]，主要包含蛋白、多糖和蛋白聚糖等物質(zhì)，在細胞骨架、細胞形態(tài)、遷移、分化、增殖等各項生理功能生命活動中扮演重要作用。常見的天然材料有：膠原(collagen)、透明質(zhì)酸(hyaluronic，HA)、纖維蛋白(fibrin)等。

合成材料包括人工高分子材料和人工合成無機材料兩類。前者是以石油天然氣等為原材料合成的高分子聚合物材料，常見的有聚乳酸(poly lactic acid，PLA)、聚羥基乙酸(poly glycolic acid，PGA)以及它們之間的各種共聚物。人工合成無機材料則是指醫(yī)用碳素材料、生物玻璃、陶瓷、合金等無機材料。合成材料降解產(chǎn)物為水和二氧化碳，毒性作用小且機械性能可控，是良好的3D支架材料。

天然支架材料和合成支架材料都廣泛應(yīng)用于3D細胞培養(yǎng)中，但是單一材料或多或少都存在缺陷以及局限性，研究者們又開發(fā)了新型復(fù)合材料。新型復(fù)合材料是將幾種不同的材料通過物理或化學(xué)方法按照不同比例合成的新材料，可以彼此互補，揚長避短，使得細胞可以在最接近生物環(huán)境中增殖分化。常見的天然材料復(fù)合的有膠原/纖維蛋白、絲素蛋白/殼聚糖、透明質(zhì)酸/絲素蛋白等，天然材料與合成材料復(fù)合的有聚己內(nèi)酯/殼聚糖、聚乳酸/絲素蛋白等。

3 3D細胞培養(yǎng)在阿爾茨海默病中的應(yīng)用

阿爾茨海默病(AD)又稱老年性癡呆，是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。該病起病隱匿，呈漸進性發(fā)展，主要臨床表現(xiàn)為記憶減退、認知能力下降，以及其他神經(jīng)精神癥狀及行為障礙，最終導(dǎo)致生活不能自理[15-17]。據(jù)文獻報道，65歲以上人群AD發(fā)病率為5.14%左右[18]。我國自20世紀80年代進入“人口老齡化社會”，到2025年老年人口將達到2.8億。2016年文獻估計，我國AD患者人數(shù)已達800萬[19]，到20世紀中葉，AD患者將接近2000萬[20]。AD已經(jīng)嚴重威脅人類健康，給患者、家庭以及社會都帶來了沉重的負擔(dān)。但是該病發(fā)病機制尚未明確，又缺乏長期有效的治療措施，使得AD的研究一直是全球?qū)W者研究的熱點與難點。

AD發(fā)病機制兩大假說分別為“β-淀粉樣肽(amyloid β-protein，Aβ)異常沉積”、“tau蛋白過度磷酸化”兩大假說[21 - 24]。前者認為，位于人體第21條染色體上的β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)基因，正常情況下，Aβ生成與降解平衡。當(dāng)APP基因突變或某些原因?qū)е翧PP代謝異常時，它被體內(nèi)的β和γ分泌酶切割，Aβ生成增多，或者降解減少，造成Aβ大量沉積，形成老年斑(senile plaques，SPs)。寡聚肽的Aβ具有神經(jīng)毒性，可以引發(fā)復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡。而“tau蛋白假說”則認為，正常情況下體內(nèi)tau蛋白磷酸化和去磷酸化處于動態(tài)平衡，當(dāng)tau蛋白磷酸化速度大于去磷酸化速度時，體內(nèi)tau蛋白含量增加，進而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。有文獻報道，AD發(fā)病過程中，存在Aβ在其毒性基礎(chǔ)上演變成為tau蛋白的過度磷酸化以及神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)的級聯(lián)反應(yīng)[25]。筆者將就阿爾茨海默病在普通2D細胞培養(yǎng)模型下無法凸顯，但在3D細胞培養(yǎng)模型中表現(xiàn)出的優(yōu)勢做簡單介紹。

3.1 促進細胞分化

大腦的神秘之處就在于其復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，單一研究某種特定細胞而不考慮各種分化細胞間的相互影響是很片面的。運用3D細胞培養(yǎng)技術(shù)，形成復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，可能會給阿爾茨海默病的研究帶來新的機會。Puschmann等[26]報告了一種新型電紡絲聚氨酯納米纖維3D細胞培養(yǎng)模型，可以用于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的體外支持，供神經(jīng)元在各個方向生長，進而形成比其他培養(yǎng)體系更復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)；Park等[27]建立了一種基于3D培養(yǎng)的微流控芯片的體外腦模型，不但形成了更加接近在體狀態(tài)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，并且與靜態(tài)條件相比，Aβ處理后的神經(jīng)球蛋白生存能力顯著下降，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)破壞也明顯。

3.2 再現(xiàn)2D培養(yǎng)模型中無法出現(xiàn)的病理過程

AD最顯著的兩大病理特征即為Aβ沉積形成的老年斑和tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)，兩者之間是否存在關(guān)系，這其中又涉及了哪些信號通路，一直都是研究人員關(guān)注的熱點問題。Zhang等[28]發(fā)現(xiàn)只有在3D培養(yǎng)條件下，才可以觀察到神經(jīng)細胞在Aβ寡聚體誘導(dǎo)下，磷酸化的p21激活激酶(pPAK)等其他相關(guān)蛋白再分配的病理變化，該過程在傳統(tǒng)的2D細胞培養(yǎng)中是觀察不到的；Choi等[29 - 33]利用ReNcell VM細胞系(ReN細胞)表達APP、PSEN1突變，產(chǎn)生FAD ReN細胞系，再通過3D細胞培養(yǎng)方法，得到一個可以加速神經(jīng)元細胞分化并形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的細胞模型，成功再現(xiàn)了Aβ積聚并驅(qū)動tau蛋白胞外聚集的病理過程；Labour等[34]開發(fā)了一個3D隔室細胞培養(yǎng)模型，當(dāng)Aβ聚集體被仿生膠原基質(zhì)隔開的時候，聚集體對細胞并無毒性，但是當(dāng)基質(zhì)孔隙被打開，聚集體與分化的大鼠嗜鉻細胞瘤細胞系(PC12)細胞接觸，顯示細胞毒性，誘導(dǎo)神經(jīng)退行性過程，作者也進一步指出，該模型可用于研究神經(jīng)突觸聚集體誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡或神經(jīng)突營養(yǎng)不良的信號通路，探究AD發(fā)病的分子機制。

4 結(jié)論及展望

3D細胞培養(yǎng)模型作為一個強有力的體外模型，自誕生之日起就不斷取得了很多令人欣慰的成就，尤其在腫瘤及高通量藥物篩選方面。但不可否認的是，目前的3D細胞培養(yǎng)技術(shù)仍有待提高。越來越多科研人員正在將3D細胞培養(yǎng)模型運用到AD的研究中，并取得初步成果。如何更好地發(fā)揮這項技術(shù)的優(yōu)勢并應(yīng)用到其他神經(jīng)退行性疾病當(dāng)中去，仍然需要生命科學(xué)、材料科學(xué)、組織工程學(xué)等各學(xué)科的專家協(xié)作努力。

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