帕金森疾病動物模型的研究進展

張志成，袁 圓，王 璇，宋慶凱，代解杰*(1.昆明醫科大學，昆明 650500； .中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心，云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室，昆明 650118)

帕金森疾病(Parkinson’s disease，PD)是一種由遺傳和環境因素相互作用引起的復雜神經退行性疾病，發病機制尚不清楚。典型特征包括運動失常、路易體(Lewy bodies，LB)形成和黑質(substantia nigra，SN)中多巴胺(dopamine，DA)神經元的喪失[1]。PD在疾病的早期階段有較好的對癥治療方法，但這些治療方法并不會改變疾病的進程。因此，可以減緩或停止PD進展的干預措施仍是亟需實現的目標。PD動物模型有助于闡明PD病因和發病機制，在新的治療方法和藥物研發中具有重大的應用價值。本文針對主要PD動物模型作一綜述。

大體上，PD的動物模型可以分為三類：基于靶向兒茶酚胺能神經元的神經毒素損傷模型、基于PD相關基因的轉基因模型以及二者的組合。目前每個模型都是模擬PD的一個或幾個病理過程，每種模型都有自己的優點和局限，都不能完全模擬PD病理特點和疾病癥狀，可以根據實驗目的選擇合適的實驗方案。

1 神經毒素模型

1.1 6-羥基多巴胺模型

6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)不能通過血腦屏障，其結構與DA神經遞質相似，對DA質膜轉運蛋白具有高親和力，誘導DA神經元和去甲腎上腺素能神經元變性，通過觸發氧化應激相關細胞毒性和小膠質細胞依賴性DA神經元炎癥，引起其毒性機制[2 - 4]。

斑馬魚腹側間腦與人類黑質致密部(substantia nigra pars compacta，SNc)解剖學相似，Vijayanathan等[5]將6-OHDA神經毒素(25 mg/kg)顯微注射到斑馬魚腹側間腦，3 d后，病理檢測顯示嗅球、端腦、中腦神經元損傷，并且行為學檢測顯示運動距離和速度明顯下降，成功建立斑馬魚PD模型。Kamińska等[6]將不同劑量的6-OHDA(8、12、16 μg/4 μL)注入Wistar Han大鼠內側前腦束(medial forebrain bundle，MFB)，研究表明，使用最高劑量的6-OHDA且無地昔帕明預處理可誘發神經和行為學改變，可用于建立晚期PD伴抑郁癥模型。Thiele等[7]的研究顯示較小的注射體積和較慢的輸注速率可確保MFB周圍結構的最小損傷，避免損傷小鼠的飲食中心，具有高的造模成功率和低的死亡率。成年大鼠的雙側SNc病變可出現危及生命的吞咽困難、渴感缺乏和運動障礙，所以很少使用。Kostrzewa等[8]采用雙側腦室內或腦池內6-OHDA給予圍產期大鼠制作PD模型，該過程不致死、不縮短壽命，大鼠行為正常，可通過高劑量左旋多巴產生的運動障礙來辨別。該模型導致黑質紋狀體神經纖維近乎完全破壞(雙側99%)和去神經支配，類似于人類嚴重PD的神經化學狀態，在評估抗PD藥物方面具有顯著的優勢。

狨猴紋狀體注射6-OHDA可導致典型的PD運動障礙，SN中酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)陽性細胞損失約63%，但無α-突觸核蛋白(α-synuclein)表達的報道[9]。Santana等[10]對狨猴MFB單側多位點給予6-OHDA(4 mg/mL，10 μL)，8周后對側采用同樣處理方法，相比8周前，雙側處理的動物出現更嚴重且穩定的運動障礙，雖然有一定程度的自發恢復，32周期間總PD評分逐漸下降。表明兩階段神經毒性損傷程序會誘發持續數月的穩定運動癥狀，該模型適用于PD新療法的長期評估。恒河猴中6-OHDA全身給藥，可建立常見的PD非運動癥狀——心臟肥大癥[11]。

6-OHDA建?？蛇x擇紋狀體、SN或MFB，6-OHDA所致的紋狀體損傷在幾周內中度持續，而MFB病變嚴重并且在1～2周內迅速發展[12]。MFB模型更適合于研究DA神經元死亡的后果，并測試治療運動癥狀的治療策略，而紋狀體模型可能更有助于闡明PD的細胞死亡機制，并測試神經保護策略[13 - 14]。

1.2 1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氫吡啶模型

1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine，MPTP)是脂溶性的，可以快速通過血腦屏障，主要通過氧化損傷和抑制線粒體呼吸鏈復合物殺死DA神經元[15]。這種模式再現了DA缺乏綜合征，而不是DA神經元進行性變性的過程。

小鼠MPTP損傷模型多出現PD運動障礙[16 - 18]，而Zhang等[19]采用雄性C57BL/6小鼠腹膜內注射MPTP[30 mg/(kg·d)]連續5 d，雖然紋狀體DA神經元損傷、α-synuclein水平升高且血腦屏障通透性改變，但沒有明顯的運動缺陷，推測可能是由于去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)系統和DA系統的補償作用。Dauer等[20]指出黑質紋狀體DA含量損失約60%～80%即DA神經元的損失量約40%～60%時，運動癥狀變得明顯。丙磺舒可以避免神經毒素的腎清除并增加毒性代謝物MPP+的水平，使DA神經元產生顯著不可逆的損失[21]。研究發現[22 - 23]用MPTP(25 mg/kg)加上丙磺舒(250 mg/kg)制作的C57/black小鼠慢性PD模型在第4周給藥后運動障礙表現最明顯，而且在5周的慢性方案中，非運動和運動癥狀逐漸出現，小鼠SNc中會出現典型的PD特征，如α-synuclein沉積物，是進行性PD的有效模型。采用雄性C57BL/6 N小鼠皮下施用低劑量MPTP(20 mg/kg，每周3次)3個月，可建立小鼠慢性PD模型。該模型死亡率低，黑質紋狀體DA神經元進行性退化，伴隨著持續的神經炎癥反應和運動缺陷，類似于PD的緩慢進行性神經變性過程。這種建模方式可能有助于建立不同階段的PD，更好地了解疾病的病理生理學，可用于測試PD中的神經保護和修復治療策略[24]。Pain等[25]評估了急性、亞急性和慢性的MPTP雄性C57BL/6小鼠模型，結果顯示各組中紋狀體DA含量損失一致(約60%)，而TH活性和DA能轉運體水平減少取決于MPTP的累積劑量。雖然急性和亞急性中毒小鼠的中腦和海馬5-羥色胺水平降低，但似乎不依賴于MPTP注射劑量，這與Rousselet等[26]研究結果一致。

在食蟹猴中，慢性和延長的MPTP給藥(0.3 mg/kg，靜脈注射，間歇性兩年，2歲給藥，10年后處死)，在剩余的SN神經元胞體和神經纖維結構中發現α-synuclein積累、磷酸化的α-synuclein免疫反應性，但無典型的LB發現[27]。獼猴連續低劑量[0.1 mg/(kg·d)]MPTP皮下注射14 d后可出現中度PD癥狀，此后隔日注射一次，4次后獼猴出現不可逆性PD運動癥狀，且可自主攝食并長期存活[28]。李鵬等[29]對獼猴后小腿皮下靜脈緩慢注入MPTP溶液(0.2～0.4 mg/kg，間隔1 d，連續5次)，3個月后評估模型情況。雖然獼猴出現典型帕金森運動癥狀、TH陽性纖維大量喪失，但未見到LB形成。史良琴等[30]采用恒河猴小劑量、長時間前臂肌內注射MPTP(0.2 mg/kg，45 d)，動物可出現典型行為學癥狀，且觀察到LB形成。但該方法存在時間長，脈沖式給藥無法做到慢毒誘導，人為干擾大等因素。Ma等[31]對樹鼩連續腹腔注射MPTP[3 mg/(kg·d)]，5 d后出現典型的帕金森運動癥狀，且紋狀體DA和DOPA水平顯著降低，腦中α-synuclein mRNA水平升高，提示樹鼩可能是研究PD發病機制的潛在動物模型。鄧苙等[32]研究指出樹鼩MPTP模型與6-OHDA模型相比，PD行為學特征更明顯，樹鼩的TH陽性神經細胞呈雙側性減少，提示MPTP經腹腔注射是制備樹鼩PD模型的理想方法。

與靈長類動物相比，嚙齒動物對MPTP毒性的敏感性較低，白老鼠幾乎不受MPP+的影響，MPTP限制在黑色小鼠或靈長類的PD動物模型中[8]。急性MPTP給藥主要引起DA能神經細胞非凋亡性死亡，而長期施用低至中等劑量的神經毒素導致由凋亡性細胞死亡引起的進行性的神經變性，可以反映PD患者大腦中的細胞分子生物學變化[33]。

2 轉基因小鼠模型

轉基因模型主要是基于家族性PD相關基因的發現，迄今為止，已經鑒定了15個致病基因和超過25個遺傳風險因子[34]，歸類為“PARK”基因和“非PARK”基因。已經證明α-synuclein水平過表達，在病理發展中至關重要。

2.1 基因敲除模型

Nuytemans等[35]研究發現PINK1(PTEN-inducedputativekinase1，PARK6)的約30種致病突變與PD相關。然而，小鼠PINK1缺失不會導致明顯的表型，迄今為止，開發的PINK1敲除(-/-)和敲低小鼠模型顯示輕度的神經退行性變化[36]。Oliveras-Salvá等[37]研究顯示重組腺相關病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)2/7載體介導的雌性C57BL/6小鼠SN中PINK1的敲低不會引起行為缺陷或DA細胞死亡、不增強α-synuclein誘導的神經病理學變化，但是在PINK1-/-小鼠中α-synuclein誘導的DA能細胞死亡和磷酸化增強。PINK1-/-小鼠SN中的DA神經元沒有喪失，但紋狀體中突觸可塑性受損[38]，表型僅顯示總DA水平的輕微降低[39]。而Glasl等[40]在PINK1-/-C57BL/6 J小鼠中觀察到DA細胞的喪失、神經變性增加，表現為PD早期癥狀。

鈣離子非依賴型磷酸酯酶A2, VIa亞型(calcium-independent phospholipase A2, group VIa，iPLA2β)基因突變PLA2G6發生于PD的多種神經疾病中。Blanchard等[41]研究顯示，雄性iPLA2β-/-小鼠4個月時，神經病理學變化很小。12個月時，小鼠出現運動障礙、小腦神經元損失和紋狀體中α-synuclein積累。15～20個月，該模型仍未出現PD特有的運動特征，僅顯示神經炎癥和PD相關的神經病理學變化。

Wang等[42]發現tetranectin基因敲除C57BL6/J小鼠(TN-/-)與年齡匹配的WT小鼠相比，12個月時，SNc中具有較少的DA神經元。DAT、二羥苯乙酸水平升高，意味著小鼠紋狀體DA能終端的代償性增加。小鼠運動遲緩、旋轉速度變慢，運動功能逐漸惡化，伴有中度至重度肢體僵硬和異常姿勢，并且無自發行為恢復。兩種基因型老年小鼠(> 18個月)的SN中α-synuclein免疫反應性均增加，但TN-/-小鼠反應更明顯，形成LB樣物質。老年TN-/-小鼠的紋狀體α-synuclein水平顯著降低。該模型可能是研究LB形成、檢測PD神經保護療法或其他突觸核蛋白病的有價值的模型。

PARK2基因(parkin基因)異常多導致青少年PD綜合征。雖然parkin-/-和WT C57BL/6 J小鼠在行為測試中沒有差異，parkin缺乏不會引起大量的SN變性或PD癥狀，但是parkin-/-誘發DA的半衰期延長，影響紋狀體的DA釋放。幼年parkin-/-小鼠中α-synuclein釋放和攝取減少表明DA神經傳遞早期癥狀的改變，而在老年parkin-/-小鼠的α-synuclein增強可能反映PD晚期癥狀前期DA功能的補償性適應。parkin的遺傳缺陷可能導致DA神經元的早發性生理功能障礙[43 - 44]。

轉基因小鼠可以在一定程度上模擬與PD類似的一些神經病理學和行為表型。然而，與PD相關大腦區域(如SNc或者藍斑)的神經元損失，大多數轉基因小鼠不會出現，并且病理學和表型的出現通常和細胞死亡一致，迄今為止的基因敲除小鼠都沒有代表PD的真實模型[45]。

2.2 病毒載體轉基因模型

到目前為止，大多數基因敲除小鼠未能顯示出明顯的DA能細胞損失和DA依賴性行為缺陷。而通過向腦中靶向輸入病毒載體，局部過表達α-synuclein，可以克服這一障礙。人α-synuclein由第4號染色體SNCA基因編碼。SNCA基因突變(包括A30P，E46K，G51D和A53T)以及SNCA倍增的特異性突變都與α-synuclein聚集增加相關聯，α-synuclein模型有助于闡明與PD相關的基因對DA神經元變性的貢獻。

Niu等[46]通過慢病毒(lentivirus，LV)載體在恒河猴卵母細胞中表達A53T α-synuclein，75個胚胎成功孕育出6只轉基因猴。雖然轉基因猴未出現明顯的DA神經元退化及運動癥狀，但出現了年齡依賴性的、嚙齒動物模型中難以模擬的PD非運動性癥狀——認知缺陷和焦慮。這與PD患者早期疾病階段非運動性癥狀一致。該模型對研究人員認識PD早期病理事件和驗證PD的治療靶點是有價值的。Eslamboli等[47]使用rAAV2/5載體在絨猴腹側中腦中表達WT、A53T α-synuclein。9周后出現運動癥狀，15周WT組運動偏倚明顯，33周后A53T組運動性能逐漸惡化，運動協調錯誤增加。兩組動物紋狀體中DA能纖維顯著退化，在腹側中腦區域A53T組比在WT組更突出。兩組動物存活DA神經元中都觀察到含有α-synuclein聚集體。這在其他嚙齒類動物模型中沒有觀察到，是研究神經保護策略和新藥的優秀工具。Van der Perren等[48]向Wistar大鼠SN部位注射攜帶A53T α-synuclein的rAAV2/7。3周后，接受劑量為3.0E11 GC/mL的大鼠中觀察到顯著的運動障礙。4周后，注射部位對側(左)前爪使用率降低了50%，DA實驗陽性。32 d后，PET成像觀察到DAT結合率降低高達85%。免疫組化顯示SN中不溶性α-synuclein陽性聚集體形成。與WT α-synuclein模型和6-OHDA模型相比較，A53T突變誘導的SN中DA細胞進行性死亡和α-synuclein陽性聚集物的形成具有時間和劑量依賴性，小鼠顯示出運動缺陷[49]。A53T模型的損傷程度比WT模型更嚴重[50 - 51]。A53T模型可能是早發性PD的合適模型。

恒河猴(大約8歲)和同年齡野生型C57/B6小鼠(10個月)相比，猴腦中反應性星形膠質細胞和軸突變性的增加，A53T α-synuclein在猴腦中顯示比小鼠更嚴重的年齡依賴性的神經毒性，且A53T α-synuclein的累積和相關病理學發展是年齡依賴性的[52]。Lauwers等[53]采用重組LV載體將WT、A30P或A53T三種α-synuclein突變基因導入Wistar大鼠SN，結果顯示神經細胞損傷不明顯，5個月時大鼠神經細胞損傷24%～35%。相對于LV載體而言，rAAV載體轉導效率可能更好、DA神經元細胞損傷更明顯、造模時間更短，AAV載體轉導效果優于LV載體[54]。

rAAV的衣殼血清型也是PD模型制作重要的考慮因素。與rAAV2/1相比較，rAAV2/7血清型轉導時間更短、DA能細胞損失更多[55 - 56]。AAV1、AAV5和AAV8血清型在SNc中轉導效率高于AAV2[57]。rAAV7血清型在小鼠SNc中顯示出高水平的α-synuclein表達，并產生了DA神經元的強烈喪失[51]。病毒載體模型動物的種類、品系和年齡在模型制作時也是應該考慮的。據報道[48]rAAV2/9-α-synuclein在C57BL/6小鼠的SNc中產生強烈的DA神經元變性，但其他品系小鼠不產生。提示研究人員在比較基因在rAAV-α-synuclein介導的表型中的作用時，應該在相同的背景下使用同基因品系小鼠。

rAAV-α-synuclein模型沒有完全概括在PD患者腦中發現的LB和路易體神經突的特征。雖然α-synuclein似乎定位于過表達α-synuclein的轉導神經元中，但是這些聚集體不具有典型LB和路易體神經突的形態學特征。

2.3 轉基因與神經毒素聯合模型

用AAV載體將α-synuclein基因單側遞送至雄性SD大鼠SN，13周后皮下植入神經毒素魚藤酮滲透性微型泵。結果發現，大鼠出現進行性運動功能障礙、黑質紋狀體神經變性和α-synuclein病理學的經典PD三聯征，受損的神經元對魚藤酮更加敏感。但是，該方法受到魚藤酮的全身毒性的限制，魚藤酮的直接大腦內遞送可能在長期研究中更有用[58 - 59]。Song等[60]在雄性C57BL/6小鼠的雙側SN中使用rAAV2/1載體過表達WT α-synuclein，8周后進行了亞急性MPTP治療。發現過表達的α-synuclein誘導黑質紋狀體進行性變性，DA神經元對MPTP的敏感性增加。在α-synuclein基因敲除雄性C57BL/6小鼠體內注射6-OHDA導致黑質紋狀體通路持續DA消耗，行為參數在兩個月內部分恢復[61]。6-OHDA毒性似乎受α-synuclein的影響，但嚙齒動物腦內6-OHDA給藥導致SN細胞損失卻不誘導α-synuclein表達導致的PD樣變化[62]。

轉基因小鼠是非常強大的工具，可以讓研究人員了解分子、細胞和整個組織水平的分子和蛋白質在體內的作用，轉基因小鼠和神經毒素兩種技術的結合將對于闡述PD分子和細胞機制，有很大的應用價值。

3 小結

MPTP和6-OHDA都是兒茶酚胺神經毒素，廣泛用于嚙齒類、樹鼩、非人靈長類動物等PD模型的創建及相關病理機制研究。6-OHDA通常采用單側治療并產生單側運動障礙，左旋多巴誘導后出現同側運動不良和旋轉行為，容易檢測和測量[63]。雙側注射低濃度的6-OHDA可用于認知的研究，因為其產生DA神經元的平衡損失并模擬PD的早期階段[64]。為了特異性靶向DA神經元，6-OHDA必須與去甲腎上腺素和5-羥色胺轉運蛋白抑制劑一起給藥[65]。MPTP引起的損傷程度和細胞死亡模式取決于給藥方案[66]。MPTP引起的運動障礙可恢復，需要高度挑戰性的行為測試來檢測。MPTP小鼠模型是測試神經保護劑的有效性的經典模型，但是在神經毒素模型中顯示神經保護作用的許多化合物在臨床試驗中失敗[67]。神經毒素模型在神經保護方面缺乏預測能力和不會出現典型LB病理學特征導致研究重點放在強調病理性α-synuclein的PD其他模型上。轉基因模型為常見且廣泛使用的神經毒素的模型提供了替代方案和補充?；蚯贸?敲入模型為相關人員研究確切的分子機制提供了研究工具，這些模型的早期癥狀學提供了靶向功能障礙途徑的可能性，但是該模型實驗周期長且對技術要求較高?；讦?synuclein的病毒載體模型具有漸進性質，允許在退行過程的不同階段進行治療干預。在AAV-α-synuclein模型中觀察到的α-synuclein與PD患者相似，表明存活的神經元保持功能失調狀態，這使得該模型在病理機制的研究中特別有用。

理想的PD模型可以模擬人類疾病的損傷分布及其隨時間的變化，但目前并沒有一個完美的模型能夠完全模擬PD所有特征。盡管廣泛認為PD是由潛在的遺傳學和暴露于環境危險因素引起的，但科學研究中仍廣泛使用單一遺傳或神經毒素來模擬PD的臨床前狀態。單一因素的模型在研究病因學、構建和表觀有效性方面都受到限制，因此綜合因素的PD模型也是值得關注的。

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