胡楊休眠莖尖的包埋玻璃化法冷凍保存研究

張 玲，田洪濤，劉錦濤，劉艷萍

(塔里木大學生命科學學院/新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

0 引 言

【研究意義】胡楊(Populuseuphratica)是國家3級珍稀瀕危植物，具有較強的抗干旱、抗鹽堿能力，是荒漠綠洲地區的主要造林樹種。對荒漠綠洲地區的防風固沙及水土保持有著重要作用。胡楊林種群自然更新能力低，應采取合適的措施對胡楊種質資源進行保存[1-3]。建立適合胡楊休眠莖尖的冷凍保存方法，對保存珍稀瀕危植物胡楊種質資源具有重要意義。【前人研究進展】液氮冷凍保存植物種質操作簡單，不需要復雜的設備，且保存時間較長，保存后的材料遺傳穩定性不受影響[4-7]。胡楊種子在常溫常濕條件下，7 d種子活力即大幅下降，15 d即失去萌發能力[8]，因此實驗嘗試對胡楊休眠芽進行液氮冷凍保存的研究。包埋玻璃化液氮冷凍法兼具包埋脫水法和玻璃化法的優點，保存后的材料有較高的存活率，且可以直接成苗[9-12]。【本研究切入點】目前采用該法保存了多種植物[7，13-18]，但是采用包埋玻璃化法冷凍保存胡楊休眠莖尖的研究尚未見報道。研究適合胡楊休眠莖尖的冷凍保存方法。【擬解決的關鍵問題】研究采用包埋玻璃化法對胡楊深冬休眠莖尖進行了液氮冷凍保存的研究，確定預培養過程中蔗糖濃度、預培養時間及不同玻璃化保護液及處理時間對胡楊休眠莖尖存活率的影響，在優化的條件下，研究建立適合胡楊休眠莖尖的冷凍保存方法。對保存后的莖尖采用相關序列擴增多態性(Sequence—related amplified polymorphism，SRAP)進行遺傳穩定性檢測。

1 材料與方法

1.1 材 料

取深冬胡楊休眠枝條，自來水浸泡24 h后，自來水沖洗1 h，然后用10%NaClO浸泡10 min后，75%酒精浸泡20 min，用無菌水沖洗2～3遍。超凈工作臺上剝取2～3 mm莖尖進行包埋。

1.2 方 法

1.2.1 制膠

用50 mL燒杯，量取10 mL純凈水，置于磁力攪拌器上，慢速旋轉。稱取0.3 g褐藻酸鈉粉末緩慢倒入燒杯中，持續攪拌約4 h，直至膠體均勻無氣泡。

1.2.2 包埋

將胡楊莖尖與制好的褐藻酸鈉混勻，用不帶針頭的注射器將莖尖滴入0.1 mol/L CaCl2溶液中固定，30 min后即成直徑約為4 mm的褐藻酸鈣膠球。

1.2.3 蔗糖預培養

將膠球投入滅菌的0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L的蔗糖溶液中振蕩培養(120 r/min,25℃)，培養時間為6、12、24、48和60 h。

1.2.4 玻璃化溶液處理

用不同配方的玻璃化保護液進行保護劑毒性實驗，選取最優配方:

A:PVS2保護液[30%甘油+15%乙二醇(EG)+15%二甲基亞砜(DMSO)+0.5 mol/L蔗糖]。

B:40%甘油+ 45%(0.4 mol/L)蔗糖+10%聚乙二醇(分子量4 000)(PEG)+5%二甲基亞砜。

C:聚乙二醇(4 000)+葡萄糖+二甲基亞砜(10∶8∶10, V/V)。

D:15%(0.4 mol/L)蔗糖+25%甘油+15%乙二醇+13%二甲基亞砜+2%聚乙二醇(分子量4 000)(V/V)。

E: 50%甘油+50%蔗糖。

1.2.5 化凍

在超凈工作臺上，將凍存管從液氮中取出擰開，將膠球倒入30℃無菌水中，快速震蕩，直至冰晶消失。

1.2.6 胡楊莖尖的培養條件[19,20]

培養基配方為MS+0.3 mg/L BA+ 1.0 mg/L ZT+ 0.1 mg/L NAA。

1.2.7 存活率及遺傳變異的檢測1.2.7.1 存活率測定

膠球化凍后接種于適合胡楊莖尖的培養基上，暗處培養24 h后移入光下培養(光強2 000 lx，光周期12∶12)，15 d后統計其存活率。

1.2.7.2 遺傳變異的檢測

(1)植物基因組DNA的獲得

采用CTAB法提取保存后胡楊莖尖單株DNA，提取的DNA用RNase進行消化RNA，檢測純度后，調至20 ng/μL備用。

(2)SRAP體系的建立

優化Li等已發表的SRAP反應體系[21]，擴增程序為94℃ 3 min，94℃ 1 min，37℃ 1 min，72℃ 2 min，5個循環；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 2 min，35個循環；72℃ 5 min[15]。擴增后的產物用聚丙烯酰胺凝膠電泳法進行分離(電泳條件：恒定功率85 W，預電泳30 min，電泳時間2 h)，銀染。

(3)遺傳穩定性

合成30對SRAP引物，對保存前后胡楊莖尖的DNA進行擴增，分析其遺傳穩定性。

2 結果與分析

2.1 蔗糖濃度和預培養時間對胡楊莖尖存活率的影響

研究表明，未經蔗糖預培養的胡楊莖尖冰凍后存活率為0。隨著蔗糖濃度的升高，冰凍后莖尖存活率逐漸升高，當蔗糖濃度為0.8 mol/L時，莖尖存活率最高，當蔗糖濃度升高至1 mol/L時，胡楊莖尖冰凍前后存活率均開始下降。圖1

注：包埋后莖尖預培養時間為24 h，經玻璃化保護液A處理20 min

Note: The dormant shoot tips was precultured for 24 h, and was treated by vitrification solution A for 20 min

圖1 預培養中不同蔗糖濃度下胡楊休眠莖尖存活率變化
Fig.1 Effect of sucrose concentration on the survival rate of dormant shoot tips in preculture

研究表明，未經冰凍的莖尖預培養48 h后，存活率大幅下降。冰凍后的莖尖，隨著培養時間的延長，莖尖存活率逐漸升高，預培養24 h后，莖尖存活率最高為67%。預培養時間延長至48 h，莖尖冰凍后存活率則開始下降。圖2

2.2 不同玻璃化保護液處理不同時間對胡楊莖尖存活率的影響

研究表明，玻璃化保護液處理是保證冰凍莖尖存活的關鍵因素。未經玻璃化保護液處理的莖尖冰凍后全部死亡。不同的玻璃化保護液對莖尖的毒性也不相同。因此，不同的玻璃化保護液處理的時間也有較大差別。玻璃化保護液A和玻璃化保護液B隨著處理時間的延長，莖尖存活率逐漸升高，處理30 min后莖尖存活率最高，分別為68%和77%。而玻璃化保護液C和玻璃化保護液E在處理20 min存活率達到最高分別為43%和17%。玻璃化保護液D在處理40 min后才達到最高存活率35%。無論是那種玻璃化保護劑，隨著處理時間的延長，存活率都開始下降。圖3

注：蔗糖濃度為0.8 mol/L，經玻璃化保護液A處理20 min

Note: The concentration of sucrose was 0.8 mol/L, and was treated by vitrification solution A 20 min

圖2 不同預培養時間下胡楊休眠莖尖存活率變化
Fig.2 Effect of preculture time on the survival rate of dormant shoot tips

注：0.8 mol/L蔗糖預培養24 h

Note: 0.8 mol/L sucrose preculture 24 h

圖3 不同玻璃化保護液處理時間下胡楊休眠莖尖存活率變化
Fig.3 Effect of different vitrification solution and treatment time on survival rate of dormant shoot-tips

2.3 冷凍保存后胡楊莖尖存活率的計算及遺傳穩定性評估

2.3.1保存后胡楊莖尖存活率的計算

將胡楊莖尖化凍經暗恢復24 h后于光下進行培養，前6 d內未見有形態顏色的變化7 d時部分變為褐色，一部分未見變化，15 d后存活莖尖轉變為綠色，即可計算其存活率。30 d即可見到的形成，即可進行遺傳穩定性檢測。冰凍前后胡楊莖尖的在形態上完全沒有差別。圖4

2.3.2 遺傳變異的檢測

實驗利用30條SRAP引物對超低溫保存后胡楊莖尖進行了遺傳穩定性分析，各SRAP 引物的擴增結果，可以看出，遺傳穩定性未發生變異。圖5

注：(a)冰凍前；(b)冰凍后

Note: (a) before freezing; (b) after freezing

圖4 冰凍前和冰凍后的休眠莖尖
Fig.4 The dormant shoot tip of Populus euphratica before and after freezing was cultured 30 d

圖5 不同SRAP引物的擴增結果
Fig.5 The results of different SRAP primers amplification map

3 討 論

低溫鍛煉和蔗糖預培養是決定超低溫保存后材料存活率的關鍵步驟。選取深冬休眠芽作為保存對象，因為材料已經適應室外寒冷的氣候，因此，可以省去低溫鍛煉。蔗糖預處理可以減少自由水含量，避免冰凍時產生冰晶。蔗糖預培養時蔗糖濃度和預培養時間是決定保存后存活率的關鍵因素。不同植物對蔗糖濃度和預培養時間的耐受力不同。對高等植物莖尖一般選用0.3～0.8 mol/L的蔗糖濃度，培養時間為24 h或者高于24 h[6,10,22]。對灰楊(PopuluspruinosaSchrenk)莖尖采用包埋玻璃化法進行液氮保存時，用0.8 mol/L蔗糖溶液預培養24 h獲得了較好的存活率[13]。而采用玻璃化保存白楊(PopulusalbaL.)莖尖時則采用0.09%的蔗糖MS培養基，在5℃條件下預培養48 h，保存效果較好[23]。實驗結果表明，胡楊與灰楊莖尖的處理條件相似，即用0.8 mol/L蔗糖溶液預培養24 h獲得了較好的存活率。包埋玻璃化法處理植物莖尖時應采用比玻璃化法稍高的蔗糖溶液，培養時間則可以稍短。

玻璃化保護液的選擇是提高莖尖存活率的關鍵因素。玻璃化保護液可以使材料脫水，并使材料發生玻璃化轉變，進入玻璃化狀態，避免產生冰晶對材料造成傷害。玻璃化保護液分為兩種：一種為低分子中性物質，可以進入細胞使溶液粘性增加，為滲透性保護劑，例如甘油、二甲基亞砜等；一種為大分子物質，溶于水后不能進入細胞，為非滲透性保護劑例如蔗糖、聚乙二醇等[4,8,9,10]。已有的研究結果表明，不同的玻璃化保護液的保護作用具有協同和累加效應，但是其毒性不累加[4,9]。實驗結果表明，非滲透性保護劑與滲透性保護劑搭配使用效果較好。在五種玻璃化保護液配方中，B配方處理后的莖尖冰凍后存活率最高為77%。同其它保護液相比，B配方中滲透性保護液含量較少，可能對材料的毒害作用較少。對灰楊的研究結果亦表明經B配方處理的莖尖冰凍后存活率較高。五種保護液配方中，E保護液配方簡單，只有甘油和蔗糖組成，用玻璃化保護液E處理的材料存活率較低，只有17%，該結果進一步表明，玻璃化保護液混合使用效果較好。

保存植物種質資源時，保持DNA的遺傳穩定性是十分重要的。因此對保存后的材料需要進行遺傳穩定性檢測。目前對保存后材料的遺傳穩定性評價一般采用分子標記的方法，例如ISSR、RAPD 和AFLP 等。研究結果表明，超低溫保存同其它植物種質保存方法相比有較好的遺傳穩定性[6,17,18]。相關序列擴增多態性(Sequence-related amplified polymorphism，SRAP)是一種顯性分子標記技術，具有簡便高效、高共顯性等特點[21]。實驗采用SRAP對保存前后的材料進行了遺傳穩定性分析，未發現變異。

4 結 論

采用包埋玻璃化法在液氮中保存珍稀瀕危植物胡楊的深冬休眠芽是可行的。深冬休眠芽已經經過抗寒鍛煉，因此可以不經低溫馴化直接保存。保存前對材料的處理是十分必要的，蔗糖預培養時采用0.8 mol/L的蔗糖溶液預培養24 h可以獲得較好的效果。玻璃化保護液應混合使用，同時應適量增加非滲透性玻璃化保護液的比例。冰凍后的材料未經愈傷組織，直接成芽。對保存后的材料進行遺傳穩定性分析，未發現變異。該方法是保存胡楊種質資源的較好方法。

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