布魯氏菌GMD重組蛋白表達及對昆明系小鼠的免疫效果研究

徐錦鳳，王 震，易德武，易繼海，馬旭升，姬 祥， 張 輝，陳創(chuàng)夫

(1.新疆石河子大學生命科學學院，新疆石河子 832000；2.新疆石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832000)

0 引 言

【研究意義】布魯氏菌病(簡稱布病)是由布魯氏菌引起的一種人獸共患傳染病[1]。動物感染后一般表現(xiàn)為流產(chǎn)、不孕、睪丸炎及關節(jié)炎等癥狀，人感染后多表現(xiàn)為波浪熱、多汗、關節(jié)痛等臨床癥狀[2]。布病的流行嚴重制約畜牧業(yè)的發(fā)展并威脅公共衛(wèi)生安全。鑒于布病造成的嚴重損失，世界上許多國家和地區(qū)制定了相應的防控和根除計劃，使用疫苗免疫在此過程中具有重要意義，尤其是在布病流行形勢嚴峻的地區(qū)。【前人研究進展】早期曾使用滅活疫苗用于人和動物的布病防控，隨后被免疫效力更好的弱毒活疫苗替代[3]。但其仍具有一定的毒力，可引起懷孕家畜流產(chǎn)，對人具有感染性，并且無法進行鑒別診斷等缺陷。因此，對毒力更弱、安全性更高且免疫效果好的布魯氏菌新型疫苗的研究是當下的研究熱點且具有重要意義，以其加強動物布病的預防和控制。gmd是布魯氏菌LPS的合成相關基因，位于LPS的Wbk區(qū)域，其編碼O-側鏈合成必須的GDP-D-甘露糖脫水酶。【本研究切入點】研究發(fā)現(xiàn)，gmd基因的缺失或突變將導致光滑型布魯氏菌的表型和毒力發(fā)生改變，從而具有良好的免疫特性[4]。gmd基因可應用于布魯氏菌亞單位疫苗的開發(fā)，而且其編碼的蛋白可能會成為布病鑒別診斷的靶抗原。【擬解決的關鍵問題】構建布魯氏菌gmd基因的原核表達載體, 通過表達純化GMD蛋白進行反應原性和免疫原性的評價，并在小鼠模型上評價目的蛋白的免疫效果。為布魯氏菌診斷方法的建立和布魯氏菌新型疫苗的開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與載體

羊種布魯氏菌16M標準株由試驗室分離保存，DH5α克隆菌株和DE3(BL21)表達菌株由該試驗室保存，pMD19-T-vector 克隆載體、pET-28a(+)表達載體購自Takara公司。

1.1.2 酶、主要試劑、實驗動物

dNTP、質(zhì)粒DNA小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京天根生物有限公司；TaqDNA聚合酶、BamH I、XhoI限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA Maker均購自Takara公司；蛋白Marker、IPTG購自上海生工；辣根酶標記兔抗羊的Ig G，辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)購自康為世紀生物技術有限公司；羊種布魯氏菌的陽性血清為該實驗室分離所得。4～6周雌性昆明系小鼠購自石河子大學實驗動物中心。

1.1.3 引物

根據(jù)GenBank上公布的羊布魯氏菌標準株16 M的gmd基因序列(序列號：BMEⅠ1413)，用Primer 5.0 軟件對gmd基因進行引物設計。該基因引物序列由北京六合華大基因有限公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR引物及序列
Table 1 Nucleotide sequences of PCR primers

PrimerPrimersequences(5＇-3＇)gmd-上游GGATCCATGAAGAAAGTCGCACTTATCA(BamHI)gmd-下游CTCGAGTTCCTTAGGGGCGAAAAAT(XhoI)

1.2 方 法

1.2.1 GMD蛋白的生物信息學

應用TMHMM Server v.2.0在線分析羊種布魯氏菌16 M的gmd的氨基酸序列，預測其蛋白跨膜區(qū)；利用Predicting Antigenic Peptides 在線預測軟件預測gmd蛋白的抗原決定簇。利用SignalP 4.1 Server預測該蛋白的信號肽。使用SOPMA在線軟件分析預測該蛋白的二級結構。利用Phyre2在線服務器三維自動建模，分析蛋白質(zhì)三級結構。表2

表2 生物信息學預測方法
Table 2 The methods of Bioinformatics prediction

預測功能Predictedfunction預測方法Predictedmethod預測網(wǎng)址PredictedURL跨膜結構預測TransmembranestructurepredictionTMHMMServerv．20http：//www．cbs．dtu．dk/services/TMHMM/信號肽預測SignalpeptidepredictionSignalP41Serverhttp：//www．cbs．dtu．dk/services/SignalP/抗原決定簇預測EpitopepredictionPredictingAntigenicPeptideshttp：//imed．med．ucm．es/Tools/antigenic．pl蛋白二級結構預測ProteinsecondarystructurepredictionSOPMAhttps：//npsa-prabi．ibcp．fr/cgi-bin/npsa＿automat．pl？page=/NPSA/npsa＿sopma．html蛋白質(zhì)三級結構預測ProteintertiarystructurepredictionPhyre2http：//www．sbg．bio．ic．a(chǎn)c．uk/phyre2/html/page．cgi？id=index

1.2.2 PMD19-T-gmd克隆載體的構建

以羊布魯氏菌標準株16M的滅活菌液(85℃水浴45 min)為模板，進行菌液 PCR 擴增，反應結束后PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠進行檢測，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段。

將回收的目的片段與 pMD19- T 載體在 16 ℃條件下過夜連接，構建重組質(zhì)粒 pMD19- T-gmd。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細胞，在氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，通過菌液PCR和雙酶切鑒定陽性克隆，將酶切大小正確的陽性質(zhì)粒送華大基因生物技術有限公司測序鑒定。

1.2.3 PET-28a-gmd表達載體的構建

用BamHⅠ和XhoⅠ對測序正確的菌株質(zhì)粒和 pET-28a 載體進行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收酶切后的目的片段和線性 pET-28a 載體，并將目的片段和線性pET-28a載體在T4連接酶的作用下連接(16℃水浴過夜)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，用卡那抗性的LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆，進行菌液PCR和雙酶切鑒定。

1.2.4 GMD重組蛋白的誘導表達與純化

將鑒定正確的陽性菌落接種于含卡那抗性的液體 LB 中，37℃ 培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)接到新鮮的 LB 中，至 OD600= 0.6 時加入 IPTG 至終濃度 1 mmol/L 繼續(xù)培養(yǎng)，分別在 0、2、4、6 h 收集菌液1.0 mL，10 625×g離心2 min收集菌體。12%SDS-PAGE 進行電泳，電泳后對凝膠進行染色、脫色、觀察結果。收集誘導培養(yǎng)6 h 后的菌體，將收集的菌體重懸于5 mL Lysis Buffer中，液氮反復凍溶處理3次；超聲破碎至菌液透亮。4℃ 10 625 ×g離心30 min。采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化目的蛋白，并經(jīng)蔗糖濃縮后進行 SDS- PAGE電泳鑒定。純化的蛋白經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒測定濃度后，-80℃ 保存。

1.2.5 Western Blot 檢測

將SDS-PAGE凝膠上的目的蛋白通過半干式轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)印到NC膜上，用western Blot 膜封閉液封閉，37℃ 作用 1 h；TBST洗滌3次，每次10 min，加入1∶500稀釋的布魯氏菌陽性血清，37℃孵育1 h；TBST洗滌3次；加入1∶2 000 稀釋的辣根過氧化物酶(HRP) 標記的兔抗綿羊IgG作用1 h，TBST洗滌3次，加入DAB底物顯色液進行顯色，用水終止反應。

1.2.6 小鼠免疫實驗

將6～8周齡昆明雄性小鼠分成實驗組和PBS組，每組20只。將GMD重組蛋白與弗氏完全佐劑1∶1乳化后通過腹腔注射接種小鼠，50 μg/只。PBS組每只注射100 μL PBS 。在免疫三周后，GMD重組蛋白與弗氏不完全佐劑1∶1乳化后加強免疫，25 μg/只。小鼠免疫后第 1、2、3周進行斷尾采血，分離外周血血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

免疫第4周后，將布魯氏菌新疆流行株043菌液稀釋成 5.0×106CFU/mL， 每組小鼠腹腔注射 0.2 mL(1.0×106CFU/mL)菌液。第6周每組分別隨機選取5只，斷頸處死。無菌摘除脾臟，并稱取小鼠脾臟質(zhì)量和體重。后用組織勻漿器研磨脾臟，10倍梯度稀釋，涂布含5%馬血清的布魯氏菌鑒別固體培養(yǎng)基，置于37℃、 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3～4 d，開始計數(shù)。

1.2.7 間接ELISA

GMD重組蛋白(10 μg/mL)經(jīng)碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋后加入酶標板(100 μL/孔)，置于4℃過夜，后用洗滌緩沖液 PBST洗板3次，每次3 min，于濾紙拍干。加入5%脫脂乳100 μL/孔，37℃封閉1 h，洗滌液PBST洗滌5次。后加入1∶40稀釋的待檢血清 100 μL/孔，37 ℃作用1 h，洗滌液PBST洗滌5次。后加入1∶4 000 稀釋的辣根過氧化物酶(HRP) 標記的羊抗鼠IgG，100 μL/孔，37℃作用1 h，PBST洗滌，之后加入 TMB顯色液(100 μL/孔)作用15 min，再用2 M硫酸(500 μL/孔)終止反應，酶標儀測定 OD450nm值。

依照ELISA試驗的陰陽性判定標準公式： P/N=(陽性血清OD值-空白對照OD值)/(陰性血清OD值-空白對照 OD 值)，如果P/N≥2.1，即為陽性。

2 結果與分析

2.1 目的蛋白的生物信息學

通過TMHMM Server v.2.0在線軟件分析得出，目的蛋白無跨膜螺旋結構。Predicting Antigenic Peptides在線預測得出gmd蛋白有15個抗原決定簇(圖2)。SignalP 4.1 Server對該蛋白氨基酸序列分析顯示，該蛋白無信號肽(圖3)。利用SOPMA在線軟件分析該蛋白的二級結構，結果顯示，GMD蛋白中有139個氨基酸參與形成α—螺旋，占所有氨基酸的38.4%；75個氨基酸參與延伸鏈的形成，占所有氨基酸的20.72%；41個氨基酸參與β-折疊的形成，占所有氨基酸的11.33%；另外，還有107個氨基酸參與無規(guī)卷曲結構的形成，占所有氨基酸的29.56%(圖4)。通過Phyre2在線服務器構建出并優(yōu)化目的蛋白的三維結構(圖5)。圖1～5

圖1 GMD蛋白跨膜結構域的預測
Fig.1 The prediction of transmembrane domain of GMD protein

nStartPositionSequenceEndPosition114DGAYLAELLLQKGYAVHG31243RIDHLYHD50352HEQGVDLTLHH62467DTSSLVRIMQLVRP80582EVYNLGAQSHVAVSF966107ALGALRLLEAIR1187126TRYYQASTSELYGLVQE1428149TPFYPRSPYAAAKLYAYWITVNY1719173EAYGIYACNGILFNH18710201ITRALAR20711246PEDFVIAT25312255KQYSVREFVTLAAK26813289KTGACIVEVDP29914306EVETLLG31215325PKISFETLVSE335

圖2 GMD蛋白的抗原決定簇預測
Fig.2 The prediction of Antigenic determinant of GMD protein

圖3 GMD蛋白信號肽的預測
Fig.3 The prediction of Signal peptide of GMD protein

圖4 GMD蛋白二級結構的預測
Fig.4 The prediction of secondary structure of GMD protein

圖5 GMD蛋白三級結構的預測
Fig.5 The prediction of tertiary structure of GMD protein

2.2 PMD19-T-gmd克隆載體的構建

以羊種布魯氏菌16M為模板，通過PCR擴增gmd基因，大小為1 089 bp；經(jīng)PCR和雙酶切方法鑒定的陽性菌送至上海生工進行測序。測序結果表明：擴增出的gmd基因與GenBank上發(fā)表的羊種布魯氏菌16M比較，堿基序列同源性100%。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，與預期大小一致。圖6

注：M. DNA marker DL2000; 1.陰性對照；2～4.gmdPCR產(chǎn)物

Note: M. DNA marker; 1. negative control; 2-4. PCR production ofgmd

圖6 PCR擴增gmd基因
Fig.6 gmd gene was amplified

2.3 PET-28a-gmd表達載體的構建

BamHI和XhoI限制性內(nèi)切酶37℃水浴雙酶切pET-28a-gmd重組質(zhì)粒，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析得出，一條帶為1 089 bp，另一條帶為5 369 bp，與理論值相符，表明gmd基因已成功插入表達載體中。圖7

2.4 GMD重組蛋白的誘導表達與純化

大腸桿菌DE3 (BL21)中重組質(zhì)粒p ET-28a-gmd在0、2、4和6 h 的誘導表達菌經(jīng)12%的SDS-PAGE凝膠電泳分析，研究表明，得到了大小為43.7 KD的GMD蛋白，與預期蛋白分子量大小一致。采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)純化，并經(jīng)蔗糖濃縮后進行 SDS- PAGE電泳鑒定。圖8，圖9

注：M. DNA標準 DL5000; 1～2. 雙酶切產(chǎn)物;3.BamH I單酶切產(chǎn)物對照; 4.XhoI單酶切產(chǎn)物對照; 5. p ET28a-gmd質(zhì)粒

Note: M. DNA Marker DL5000 ;1-2. Identification of pET-28a-gmdrecombinant plasmid with double enzyme identification; 3. pET-28a-gmdrecombinant plasmid withBamH I enzyme; 4. pET-28a-gmdrecombinant plasmid withXhoI enzyme; 5. PET- 28a-gmdrecombinant plasmid control

圖7 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定
Fig.7 The double enzyme identification of recombinant plasmid

注：M.蛋白分子質(zhì)量標準；1.E.coliBL21(DE3)；2.IPTG誘導0 h的pET-28a-gmd；3.誘導2 h；4.誘導4 h；5.誘導6 h

Note: M. Protein Molecular Marker; 1.E.coliBL21(DE3); 2, Induced pET-28a-gmdfor 0 h by IPTG; 3.Induced 2 h ; 4．Induced 4 h ; 5. Induced 6 h

圖8 重組蛋白pET-28a-gmd誘導表達
Fig.8 Induced expression of the recombinant protein pET-28a-gmd

圖9 GMD蛋白純化
Fig.9 Purification of GMD protein

2.5 Western blot 鑒定

將GMD蛋白與布魯氏菌自然感染綿羊的陽性血清進行WB試驗，結果顯示表達的GMD蛋白可在43.7 Ku的位置上有一條特異的反應條帶，此結果與預期一致。表明重組蛋白GMD與抗布魯氏菌抗體發(fā)生特異性反應；說明重組GMD蛋白與相應天然蛋白具有相同的抗原性。圖10

注：1.GMD蛋白與陽性血清反應; M.蛋白分子質(zhì)量標準

Note: 1. The GMD protein reacts with the positive serum;M. Protein Molecular Marker

圖10 GMD蛋白Western Blot 試驗
Fig.10 Western Blot assay of GMD protein

2.6 小鼠血清抗體水平檢測結果

用GMD蛋白作為包被抗原，通過間接ELISA法對各組小鼠血清進行抗體水平檢測，最后測得各組小鼠血清的OD450值。結果顯示，免疫后從第7～21 d，各組小鼠血清抗體水平都有大幅增加，并且在第21 d達到最高峰。且每次免疫后產(chǎn)生的抗體與PBS組對比均有極顯著性差異(P≤0.01)。且第7和第21 d的抗體水平比較具有顯著性差異(P≤0.05)。圖11

圖11 小鼠血清抗體水平測定
Fig.11 The level of antibody of mouse serum immunized by indirect ELISA

依照ELISA試驗的陰陽性判定標準公式換算后的結果表明，三組試驗組結果均大于2.1，結果均有效，表明小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了特異性抗體。從表3可以看出：從第7～21 d，實驗組小鼠血清抗體水平都有大幅增加，試驗結果證明GMD有較好的免疫原性。表3

表3 小鼠血清 P/N 值換算結果
Table 3 The conversion result of mouse serum P/N values

組別P/N值7d14d21dGMD222630

2.7 免疫后小鼠保護力測定

將免疫6周的小鼠進行脾臟指數(shù)測定。首先，每組隨機選取5只小鼠，利用電子天平進行體重測定和脾臟質(zhì)量測定。最后根據(jù)公式：脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體重×100%得出結果。 在免疫第6周時，GMD組較PBS組差異極顯著(P≤0.01)，GMD組小鼠脾指數(shù)明顯低于PBS組。圖12

將免疫后6周小鼠進行脾臟 CFU 計數(shù)。將每組無菌操作取出的脾臟用組織勻漿器研磨20 min，10 倍梯度稀釋，涂布含5%血清布魯氏菌鑒別固體培養(yǎng)基。 結果發(fā)現(xiàn)，GMD組脾臟載菌量為4.7 log 單位，而PBS組脾臟載菌量為5.8 log 單位，低于PBS組且差異顯著(P≤0.05)。圖13

在該實驗中，與注射PBS的小鼠相比，保護被定義為小鼠用毒力菌株043攻擊后免疫小鼠的脾指數(shù)的降低和脾臟中的細菌數(shù)目的顯著減少。結果表明，GMD組脾指數(shù)和脾臟載菌量均顯著低于PBS組，GMD蛋白在小鼠模型上發(fā)揮了免疫保護的作用。

圖12 小鼠脾臟指數(shù)測定
Fig.12 The determination of murine splenic index

圖13 小鼠脾臟 CFU
Fig.13 The CFU of murine spleen

3 討 論

羊種布魯氏菌、牛種布魯氏菌、豬種布魯氏菌是人畜共患病感染的最常見的致病因素，因此是全球最重要的臨床重要病原體[5]。在家禽和野生動物中，布魯桿菌感染主要在妊娠晚期導致女性墮胎，男性睪丸炎和附睪炎[6]。因此布魯氏菌病在世界許多地區(qū)仍然是一個重大的人類健康威脅。其完整的基因組測序和分析以及新型生物技術的出現(xiàn)有助于開發(fā)改進可用疫苗和制備新型疫苗的方法。對于人類布魯氏菌病預防，重組蛋白疫苗，亞單位疫苗，外膜囊泡和載體疫苗的開發(fā)是潛在的選擇[7]。

目前, 針對與布魯氏菌 LPS合成有關的基因進行研究成為進一步改造疫苗或建立診斷方法的新方向。LPS 是布魯氏菌重要的毒力因子之一[8]。LPS含有O-鏈多糖,使得現(xiàn)在的疫苗因存在血清學干擾而無法推廣使用。Godfroid最先分析了參與羊種布魯氏菌O抗原合成的關鍵基因，初步揭示了wbkA,gmd,wzm,wzt,wbkB,wbkC等基因在O-側鏈合成中的作用[9]。gmd編碼與光滑型布魯氏菌脂多糖的O -鏈合成相關的GDP甘露糖脫水酶。gmd在O抗原合成中發(fā)揮著重要作用，其缺失株會導致菌株缺乏O 抗原合成的能力成為粗糙型[10]。

4 結 論

大量的布魯氏菌亞單位組分作為重組蛋白疫苗已經(jīng)在小鼠模型上被評價，并且已經(jīng)證明一些重組蛋白具有保護作用[11]。研究通過生物信息學分析對布魯氏菌脂多糖蛋白ManB進行生物信息學分析，初步預測其結構和功能。GMD蛋白沒有跨膜結構，其蛋白可能不參與胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導。研究抗原表位預測結果顯示該蛋白有一定數(shù)量的抗原決定簇，這表明其作為抗原可能引起良好的免疫應答反應。該蛋白沒有信號肽，意味著該蛋白屬于非分泌性蛋白，不能被分泌到胞外發(fā)揮作用。GMD蛋白二級結構主要以α-螺旋為主，其是通過骨架上的羰基和酰胺基團之間形成的氫鍵維持的。研究對該gmd基因進行了原核表達和重組蛋白純化，通過Western Blot驗證了GMD蛋白良好的反應原性，并在小鼠模型上進一步驗證了該蛋白良好的免疫原性，且具有一定免疫保護力。證實了該蛋白具有成為布魯氏菌亞單位疫苗優(yōu)勢抗原的潛力。

)

[1] Moreno, E. (2014). Retrospective and prospective perspectives on zoonotic brucellosis.FrontiersinMicrobiology, 5(2): 213.

[2] Galińska, E. M., & Zagórski, J. (2013). Brucellosis in humans--etiology, diagnostics, clinical forms.AnnalsofAgricultural&EnvironmentalMedicineAaem, 20(2):233-238.

[3] 景志剛, 嚴家瑞, 范偉興. 布魯氏菌病疫苗研究進展[J]. 中國人獸共患病學報, 2016, 32(2):188-199.

JING Zhi-gang, YAN Jia-rui, FAN Wei-xing. (2016). Research progress of brucellosis vaccines [J].ChineseJournalofZoonoses, 32(2):188-199. (in Chinese)

[4] Cloeckaert, A., Grayon, M., Verger, J. M., Letesson, J. J., & Godfroid, F. (2000). Conservation of seven genes involved in the biosynthesis of the lipopolysaccharide o-side chain in brucella spp.ResearchinMicrobiology, 151(3): 209-216.

[5] Dahouk, S. A., Neubauer, H., & Sprague, L. D. (2014). Brucella (B. abortus, B. melitensis, and B. suis) Sascha Al Dahouk, Heinrich Neubauer, and Lisa D. Sprague.ManualofSecuritySensitiveMicrobesandToxins.

[6] ENRIGHT, F.M. (1990): The Pathogenesis and pathobiology of Brucella infection in domesticanimals.Animalbrucellosis, (55):301-320.

[7] Wang, Z., & Wu, Q. (2014). Research progress in live attenuated brucella vaccine development.CurrentPharmaceuticalBiotechnology, 14(10): 887.

[8] Lapaque, N., Moriyon, I. E., & Gorvel, J. (2005). Brucella lipopolysaccharide acts as a virulence factor.CurrentOpinioninMicrobiology, 8(1): 60-66.

[9] Godfroid, F., Cloeckaert, A., Taminiau, B., Danese, I., Tibor, A., & Bolle, X. D., et al. (2000). Genetic organisation of the lipopolysaccharide o-antigen biosynthesis region of brucella melitensis, 16m ( wbk ).ResearchinMicrobiology, 151(8): 655-668.

[10] 易德武.羊種布魯氏菌015株gmd、per和manb缺失株的構建及診斷抗原反應原性評價研究[D]. 石河子：石河子大學, 2015.

YI De-wu. (2015).ResearchonConstrulctionandImmunogenicityofgmd,perandmanbMutantStrainsofBurcellaMelitensis015 [D]. Master Thesis. Shihezi University, Shihezi. (in Chinese)

[11] Oliveira, S. C., Giambartolomei, G. H., & Cassataro, J. (2011). Confronting the barriers to develop novel vaccines against brucellosis.ExpertReviewofVaccines, 10(9): 1,291-1,305.