中藥復方多糖對不同MHC B-LβII基因型雞淋巴細胞IL-2、IL-4、IL-12 mRNA表達量的影響

馬 昭，連科訊，劉 鋼，劉曉婷，喬嚴杰，朱曉慶，谷新利

(石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】中藥是我國的傳統藥物，它資源豐富、歷史悠久，與西藥相比具有毒副作用小，低殘留，不易產生耐藥等優點，是醫藥學研究的熱點。隨著中藥藥理學、遺傳學、免疫學的相互滲透，人們對中藥與機體免疫調節作用的研究愈加深入，發現中草藥中的多種提取物可以參與機體免疫調節。中藥多糖是一種從中草藥中提取出的具有提高機體免疫力，抗病毒，抗氧化等多種作用的生物活性物質之一，它能夠通過激活T、B 淋巴細胞和巨噬細胞等免疫細胞，促進細胞因子的生成，激活補體系統等方式調節機體免疫系統，進而發揮免疫調節作用。并且中藥多糖的免疫調節作用受劑量的影響，即中藥多糖的免疫增強作用有其最適劑量[1-3]?！厩叭搜芯窟M展】細胞表面存在著與免疫排斥有關的組織抗原，稱為組織相容性抗原(histocompatibility antigen),而編碼組織相容性抗原的是具有高度多態性的基因群，稱為主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)。MHC編碼的蛋白與免疫識別、免疫應答有關，因此MHC在某種程度上決定動物個體對疾病的易感性，在適應性免疫應答中起著非常重要的作用。Shanaz等[4]應用PCR-SSCP方法對Bantam、BWLH和WLH 3個雞種的MHCB-LβII多態性與免疫應答相關性進行研究，發現B-Lβ II基因的等位基因B15和B19單倍體雞ND和SRBC抗體滴度均顯著高于其他單倍體，是優勢基因型。朱曉慶等[5]研究發現，一定純度中藥復方多糖的免疫調節劑量的篩選會受MHCB-LβII基因Hin1I位點多態性的影響，且一定純度中藥復方多糖對不同MHCB-LβII基因型雞的最適免疫調節劑量不同?！颈狙芯壳腥朦c】MHC II類分子不僅被CD4 T細胞識別，是CD4 T識別的靶分子，而且參與外源性抗原呈遞、免疫應答和免疫調節。不同個體間由于MHC II基因多態性使得MHC II 類分子接納與提呈抗原具有一定的選擇性，導致不同個體對同一抗原表現出免疫應答強弱的差異。【擬解決的關鍵問題】試驗從細胞分子水平擬排除MHCB-LβII多態性而導致的不同基因型機體免疫應答能力不同的影響，篩選出能顯著增強與雞免疫功能相關的各MHCB-LβII基因型雞免疫的中藥復方多糖的最佳劑量。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 藥物

中藥復方多糖由黨參、山楂、熟地、何首烏、當歸、茯苓、補骨脂等11味中藥組成，各單味藥均購自石河子市醫藥公司；中藥復方多糖粗提取物是從中藥復方中采用水提-醇沉法提取，再經AB-8大孔吸附樹脂吸附解吸附后獲得精制的中藥復方多糖，即cCHMPS，其純度為77.10%；用不含血清的RPMI-1640培養液將其配置成200、150、100 μg/mL的cCHMPS，經0.22 μm微孔濾膜濾過后4℃儲存備用。

1.1.2 試劑與儀器

雞外周血淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司產品)；RPMI 1640培養基，PBS磷酸緩沖液，胎牛血清，SYBR Green熒光染料，RT-PCR試劑(北京全式金生物技術有限公司產品)；DEPC(上海生物工程公司產品)；雞新城疫疫苗(La Sota株，普萊柯生物工程股份有限公司產品)；TaqDNA聚合酶，RNA、DNA提取試劑盒，膠回收試劑盒，RNAprep Pure Cell/Bacteria k-it(北京田根生物工程有限公司產品)；高速冷凍離心機，垂直離心機。

1.2 方 法

1.2.1 DNA的提取

500羽1日齡京紅1號蛋雞，購自新疆昌吉某一孵化場。翅下靜脈采血0.2 mL/羽，置于肝素鈉抗凝采血管中搖勻，-20℃冷凍保存。按DNA提取試劑盒的操作說明書提取雞全血DNA，4℃冰箱保存備用。

1.2.2 引物設計

根據GenBank中收錄的雞MHC B-LβⅡ基因序列(NO.M29763.1)，應用Oligo軟件設計引物，引物序列為：上游引物：5’-AAACCGACCGTCTGGCGTGCTA-3’，下游引物：5’-TTACCCCACGCCTGGCTGAT-3’，擴增片段238 bp，引物由華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增

PCR擴增體系為20 μL：10 μL 的2×RCRMix，2 μL模板DNA，上下游引物各0.5 μL，7μL ddH2O，總體積為20 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性40 s，60.5℃退火45 s，72℃延伸35 s，共35個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。取5 μL PCR 擴增產物在2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統觀察并拍照。

1.2.4 淋巴細胞的分離與成活率檢測

根據PCR-SSCP基因型分型結果將雞進行分組，然后靜脈采集血液參照文獻謝昆等[6]提取淋巴細胞，用胎盤藍染色，在顯微鏡下數出死細胞和活細胞個數，計算活細胞的成活率。

1.2.5 試驗分組與細胞培養

用含20%的胎牛血清的培養液將分離得到的淋巴細胞調整為5×106個/mL。試驗按不同基因型分組，每組設3個劑量組，每個培養皿加入1 mL細胞培養液，然后加入不同濃度的cCHMPS，使終濃度分別達到100、75、50、0 μg/mL。將培養皿置于37℃、5%的CO2的恒溫培養箱中共培養24 h后收集細胞。

1.2.6 雞淋巴細胞總RNA提取

收集淋巴細胞，按照RNA提取試劑盒說明書提取淋巴細胞的總RNA。RNA純度檢測：檢測其D260 nm/D280 nm比值，其比值在1.8～2.0。

1.2.7 RNA反轉錄

將2 μL 5×gDNA Graser Buffer、1 μL gDNA Eraser、5 μL RNase Free Water、2 μL RNA模板混勻，42℃反應2 min，迅速冰浴，即反應液Ⅰ，最后將1 μL Prime Scriptrt MIXⅠ、1 μL RT Primer MIX、4 μL 5×Primscript buffer、4 μL RNase Free Water加入反應液Ⅰ中，37℃反應15 min，85℃加熱5 s使反轉錄酶失活，取出EP管，-20℃貯存備用。

1.2.8 cDNA的PCR反應體系與程序

IL-2、IL-4、IL-12及β-Actin基因的引物設計與合成：根據GenBank報道的IL-2、IL-4、IL-12及β-Actin基因mRNA的全長序列設計RCR特異性引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列及PCR條件
Table 1 Conditions of PCR and parameters of oligonucleotide primer pair

目的基因Targetgene登錄號GenBankNo產物Products引物序列(5′→3)Sequenceofprimer(5′→3)退火溫度AnnealingtemperatureIL-2GU＿119890．1188bpF：CACACCAACTGAGACCTGR：TCTTGCATTCACTTCCGGTGT58℃IL-4GU＿119892．1382bpF：AACATGCGTCAGCTCCTGAAR：CCATTGAAGTAGTGTTGCCTGCT60℃IL-12NM＿213571．1133bpF：GAGTGGAACGATGAGACACCAGR：CCTTCACTTCGGTGGTCAGAG58℃β-ActinNM＿205518．1100bpF：ACCGCAAATGCTTCTAAACCR：ATAAAGCCATGCCAATCTCG59℃

cDNA的PCR反應體系：1 μL cDNA模板，上游引物和下游引物各0.5 μL，8 μL ddH2O，10 μL 的2×RCRMix，總體積為20 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環；72℃延伸10 min；4℃保存。

1.2.9 實時熒光定量PCR

熒光定量PCR反應體系：2×TransStart?Tip Green qPCR SuperMIX 10 μL，上下游引物各0.5 μL，1 μL cDNA，8 uL ddH2O，20 μL體系。反應程序為：94℃預變性30 s；94℃變性5 s；退火15 s，72℃延伸10 s，共42個循環。

1.3 數據處理

用 2 -△△ Ct法計算目的基因IL-2、IL-4、IL-12 mRNA的相對表達量。所有數據結果以均數±標準差( x±SD)表示。用 SPSS 17.0 軟件分析，計量資料采用t檢驗，所有統計分析結果以P<0.05 作為差異顯著性的判斷標準，并且將對照組的mRNA的相對表達量設置為1。

2 結果與分析

2.1 MHC B-LβII基因PCR擴增結果

用所設計的引物對基因組DNA進行擴增，取所得PCR產物5 μL于的瓊脂糖凝膠上進行電泳，擴增產物檢測結果為，所設計引物的擴增結果較好，片段長度與預期大小一致，條帶清晰，無非特異性條帶，可直接進行SSCP分析。圖1

1：DNA Maker I， 2-11：MHC B-LβII基因(MHC B-LβII Gene)

圖1 MHC B-LβII基因PCR擴增結果
Fig.1 The PCR amplification results of MHC B-L II gene

2.2 PCR-SSCP

對所有DNA樣本的PCR產物進行SSCP多態性檢測，發現所擴增片段有3種基因型，分別定義為AA (103羽)、BB(266羽)和BC(131羽)。圖2

注：1、6、8、10、12：BC基因型；3、5：AA基因型；2、4、7、9、11、13：BB基因型

Note: 1、6、8、10、12：BC genotype； 3、5：AA genotype； 2、4、7、9、11、13：BB genotype

圖2 部分雞MHC B-LβII基因PCR-SSCP電泳圖譜
Fig.2 Electrophoretic patterns of the PCR-SSCP product of MHC B-LβII gene

2.3 IL-2、IL-4、IL-12及β-Actin擴增結果

用所設計的雞IL-2、IL-4、IL-12及β-Actin 基因的引物，以 cDNA 為模板進行 PCR擴增，經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別獲得了188、382和133 bp的目的條帶。圖3

2.4 中藥復方多糖對不同MHC B-LβII基因型雞外周血淋巴細胞中IL-2 mRNA表達量

研究表明，與對照組相比，cCHMPS能顯著促進雞淋巴細胞IL-2 mRNA的表達，且在不同基因型雞中，最有效提高IL-2 mRNA表達量所需的cCHMPS劑量不同。AA基因型雞中，cCHMPS劑量為75、50 μg/mL時，雞淋巴細胞IL-2 mRNA表達量顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BB基因型雞中，cCHMPS劑量為100 μg/mL時雞淋巴細胞 IL-2 mRNA表達量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BC基因型雞中，cCHMPS劑量為50 μg/mL時，IL-2 mRNA表達量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)。表2

1: IL-12基因(IL-12 gene)；2：IL-4基因(IL-4 gene)；3：IL-2基因(IL-2 gene)；4：內參(β-Actin gene)；5：Maker

圖3 IL-2、IL-4、IL-12及β-Actin凝膠電泳圖
Fig.3 Electrophoretic patterns of the PCR product of IL-2、IL-4、IL-12 and β-Actingene表2 中藥復方多糖對各基因型雞淋巴細胞IL-2 mRNA表達
Table 2 Effect of traditional Chinese medicine compound polysaccharide of each genotype chicken IL-2 mRNA expression level

基因型Genotype不同劑量的中藥復方多糖 DifferentdosesofChineseherbalcompoundpolysaccharides0μg/mL50μg/mL75μg/mL100μg/mLAA基因型 AAGenotype1189±001a?182±002a?166±002b?BB基因型 BBGenotype1167±004a?163±005a?181±002b?BC基因型 BCGenotype1176±006a?164±005b?165±003b?

注：同行肩注小寫的字母表示同一基因型組不同cCHMPS劑量間的比較，肩注相同小寫字母差異不顯著(P>0.05)，肩注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，cCHMPS與對照組比較用*表示顯著性差異(P<0.05)，下同

Notes : Comparison of cCHMPS doses between the same genotype groups, Shoulder note same, lowercase letters are not significant difference(P>0.05), and different weight letters indicate significant difference(P<0.05). The difference between cCHMPS and control group was marked by*.The same as below

2.5 中藥復方多糖對不同MHC B-LβII基因型雞外周血淋巴細胞中IL-4 mRNA表達量

研究表明，與對照組相比，cCHMPS能顯著促進雞淋巴細胞IL-4 mRNA的表達，且在不同基因型雞中，最有效的提高IL-4 mRNA表達量所需的cCHMPS劑量不同。AA基因型雞中，cCHMPS劑量為75、50 μg/mL時，雞淋巴細胞IL-4 mRNA表達量顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BB基因型雞中，cCHMPS劑量為100 μg/mL時雞淋巴細胞 IL-4 mRNA表達量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BC基因型雞中，cCHMPS劑量為50 μg/mL時，IL-4 mRNA表達量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)。表3

表3 中藥復方多糖對各基因型雞淋巴細胞IL-4 mRNA表達
Table 3 Effect of traditional Chinese medicine compound polysaccharide of each genotype chicken IL-4 mRNA expression level

基因型Genotype不同劑量的中藥復方多糖 DifferentdosesofChineseherbalcompoundpolysaccharides0μg/mL50μg/mL75μg/mL100μg/mLAA基因型 AAGenotype1178±003a?179±004a?160±002b?BB基因型 BBGenotype1164±002a?161±003a?171±006b?BC基因型 BCGenotype1166±005a?160±002b?159±002b?

2.6 中藥復方多糖對不同MHC B-LβII基因型雞外周血淋巴細胞中IL-12 mRNA表達量

研究表明，與對照組相比，cCHMPS能顯著促進雞淋巴細胞IL-12 mRNA的表達，且在不同基因型雞中，最有效的提高IL-12 mRNA表達量所需的cCHMPS劑量不同。AA基因型雞中，cCHMPS劑量為75、50 μg/mL時，雞淋巴細胞IL-12 mRNA表達量顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BB基因型雞中，cCHMPS劑量為100 μg/mL時雞淋巴細胞 IL-12 mRNA表達量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)；BC基因型雞中，cCHMPS劑量為50 μg/mL時，IL-12 mRNA表達量均顯著高于其他劑量組(P<0.05)。表4

表4 中藥復方多糖對各基因型雞淋巴細胞IL-12 mRNA表達
Table 4 Effect of traditional Chinese medicine compound polysaccharide of each genotype chicken IL-12 mRNA expression level

基因型Genotype不同劑量的中藥復方多糖 DifferentdosesofChineseherbalcompoundpolysaccharides0μg/mL50μg/mL75μg/mL100μg/mLAA基因型 AAGenotype1219±003a?221±007b?189±004b?BB基因型 BBGenotype1190±004a?186±008a?218±003b?BC基因型 BCGenotype1220±009a?192±003b?196±004b?

3 討 論

3.1 中藥復方多糖對雞淋巴細胞IL-2、IL-4、IL-12 mRNA表達量的影響

機體淋巴細胞在免疫應答中起著關鍵的作用[7]。淋巴細胞分泌的細胞因子是天然的免疫調節劑，是介導和調節免疫、炎癥反應的一類細胞小分子糖蛋白，可以使靶細胞進行分化和增殖，進一步增強抗疾病的能力，參與調節機體的炎癥反應以及免疫應答[8]。研究細胞因子有助于了解機體的免疫調節機制，近年研究發現中藥多糖可以促進細胞因子分泌，其中IL-2、IL-4、IL-12等細胞因子在免疫應答中也充當著十分重要的角色。IL-2、IL-4、IL-12主要由淋巴細胞產生，在細胞生長分化和機體免疫調節作用中發揮著各自特有的作用。IL-2、IL-12是Th1細胞分泌的，激活巨噬細胞，通過調節巨噬細胞MHC II分子的表達,進而促進Th細胞分化為Th1細胞，最終增強機體的特異性免疫。IL-2不僅促進T、B淋巴細胞增生與分化產生抗體，而且在獲得性免疫和機體天然免疫的發生與維持中發揮著重要作用[9-10]。此外，研究表明雞IL-2蛋白可以作為免疫增強佐劑[11]。IL-4由Th2細胞分泌，可以抑制Th1細胞活化的能力，同時是IgE的誘導劑。IL-12具備多種免疫調節功能，不僅可以調節Th1細胞的活性，促進Th1細胞分泌細胞因子，增強Th1細胞的免疫應答，而且可以促進T細胞和NK細胞的增殖及殺傷作用，同時可以抑制Th2細胞分泌免疫因子的產生，即Th1細胞分泌的細胞因子可以抑制Th2細胞的增殖，反過來Th2細胞分泌的細胞因子可以調節Th1細胞的分化。

有研究表明，中藥多糖能影響白介素，如IL-2、IL-4、IL-12的生成和表達，進而對機體進行免疫調節[12]。商云霞等[13]研究了中草藥復方多糖對雞INF-γ、IL-4和IL-12質量濃度的影響，發現不同劑量中藥復方多糖均能提高INF-γ、IL-4和IL-12質量濃度，且中劑量中藥復方多糖最好。李婉雁等[14]研究了白術多糖(PAM)對嶺南黃雞免疫功能的影響，結果發現PAM能促進雛雞免疫器官中TNF-α、IL-2、IL-4及INF-γ mRNA的表達，且PAM有一定的劑量限制。徐占云等[15]研究了枸杞多糖(LPB)對雛雞淋巴細胞體外增殖及分泌IL-2的影響，研究結果顯示LPB能促進雛雞淋巴細胞增殖和IL-2的分泌。Huang等[16]報道，地黃多糖能上調T淋巴細胞IL-2的分泌水平。另外，還有研究顯示補益類中藥有效成分可以促進IL-12、IL-2等細胞因子分泌，加強細胞因子的作用，激活B、T細胞，增強機體的細胞免疫和體液免疫，調節機體免疫，而中藥多糖是其中藥成分之一[17]。試驗研究表明，不同劑量cCHMPS均能提高各基因型雞IL-2、IL-4、IL-12 mRNA表達量，提示中藥多糖增強機體抗病能力的分子機制之一可能是促進細胞因子分泌。當然，中藥多糖雖然能促進機體IL-2、IL-4、IL-12 mRNA表達，但是并非越高越好，三者之間必須處于一定的平衡狀態，才能維持機體正常的的體液免疫和細胞免疫。

3.2 雞MHC B-LβII基因多態性對cCHMPS促進淋巴細胞IL-2、IL-4、IL-12 mRNA表達的劑量影響

雞MHC基因家族在機體內發揮著很重要的生物學功能，同時雞MHC抗原在體液免疫和細胞免疫中都發揮著重要的作用。T細胞表面有抗原結合的受體，簡稱TCR(T cell receptor)。TCR具有特異性，只與特定的抗原結合， TCR只識別結合在自身MHC分子上的抗原。大多數T細胞含有CD4和CD8膜分子，表達的CD4 T細胞只識別MHC II類分子遞呈的抗原。CD4 T細胞作為輔助性T細胞(Th)，通過識別抗原遞呈細胞(antigen-presenting cell，APC)MHC II類分子遞呈的抗原而被活化，活化后的Th細胞分裂增殖，同時分泌各種細胞因子，參與調節免疫應答。此外，T細胞在識別外來抗原同時，還要識別MHC分子，說明T細胞受體在識別抗原需要依賴與抗原遞呈的MHC分子[18]。

許多研究表明雞多種傳染病的抗性高度與MHC基因多態性相關，所以在研究家禽抗病育種試驗中MHC基因成為了優選的標記基因[19]。李福偉等[20]研究表明個體以及品種之間存在不同免疫能力的遺傳差異，并且不同的免疫性狀存在顯著的優勢基因型。李尚民等[21]的研究發現雞MHCB-LβII基因外顯子2的遺傳變異對京海黃雞抗病能力影響顯著，可作為球蟲抗病能力選育候選基因。劉立波等[22]研究了雞MHC B-L基因SNPs單倍體型與血清中IgG含量、LPS含量、禽流感(AI)抗體滴度等免疫性狀關系，結果表明，不同免疫性狀存在顯著相關的優勢SNPs單倍型。楊紅洋等[23]研究了中藥復方多糖對不同MHCB-LβII基因型雞血清細胞因子質量濃度的影響，發現MHCB-LβII基因多態性使雞血清細胞因子IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α質量濃度產生差異。試驗研究結果顯示，同一劑量cCHMPS對不同基因型雞淋巴細胞的IL-2、IL-4、IL-12 mRNA表達量不同，此研究結果與李福偉、李尚民、劉立波、楊紅洋等[20-23]的究結果相一致，說明不同免疫能力存在個體水平上的差異。試驗出現此結果的原因有可能是MHC II類分子對中藥多糖的感知有一定濃度范圍，BC基因型雞對高劑量中藥多糖產生免疫耐受，導致機體免疫效果低于低劑量的中藥復方多糖。

但此次試驗中，僅僅研究了京紅 1 號蛋雞，且雞的數量及免疫相關指標均較少，要確定中藥復方多糖最適免疫劑量的篩選是否受雞基因多態性的影響，還需增加雞的品種，擴大試驗雞的數量，增加體內、體外免疫指標，進行深入研究。

4 結 論

中藥復方多糖能顯著提高機體免疫力，且50 μg/mL中藥復方多糖對AA、BC基因型雞，100 μg/mL中藥復方多糖對BB基因型雞淋巴細胞的免疫效果顯著，提示中藥復方多糖的免疫增強作用有最適濃度且MHCB-LβII基因多態性可能影響中藥復方多糖免疫增強作用的最佳劑量，從經濟角度考慮，確定添加50 μg/mL的中藥復方多糖組對雞淋巴細胞的免疫效果最優。

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