中藥復方多糖對不同MHC B-LβII基因型蛋雞禽流感抗體效價的影響

劉曉婷，朱曉慶，馬 昭，喬彥杰，張保軍，谷新利，商云霞

(石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】禽流行性感冒(Avian Iafluenza，AI)簡稱禽流感，是由 A 型流感病毒引起的烈性傳染病，被世界動物衛生組織(OIE)列為 A 類傳染病[1]，我國將禽流感列為重大動物疫病和一類傳染病[2]。近年來，由于抗生素的濫用，禽流感病毒的變異及強毒株的出現等原因[3]，在家禽生產中普遍存在疫苗接種效果不佳或免疫失敗等問題[4]。有臨床實踐表明，疫苗與免疫佐劑或免疫增強劑配合使用，是疫苗發揮良好防疫效果的有效手段之一[5,6]。中藥多糖是從中草藥中提取出的具有免疫增強[7]、抗感染[8]、抗病毒[9]、調節造血功能[10]等多種生物活性作用的成分之一，它毒副作用小，殘留量低，具有開發成療效確定、性質穩定、毒副作用小的免疫增強劑的前景[11]。【前人研究進展】多糖類物質是一種T細胞依賴性抗原，能被MHC II類分子處理和呈遞，進而被TCR識別，參與機體細胞免疫，亦能有效激活B淋巴細胞，誘導特異性抗體產生[12]。主要組織相容性復合體(MHC)參與機體內、外抗原的呈遞，影響機體對疾病的抵抗力，是動物抗病育種的主要候選基因群之一[13]。有研究表明，雞MHC B-Lβ基因多態性對機體免疫反應具有廣泛調節作用[14,15]，且與禽類對傳染性疾病的抗性高度相關[16]。有關和禽流感病毒的相關性研究目前很少，Boonyanuwat等對泰國禽流感爆發中心的抗病型雞群和易感型雞群進行單倍型驗證，發現部分具有抗病性的泰國地方雞種得以存活，其抗病特性與免疫遺傳有關，特別是與MHC I類和MHC II類分子有關，MHC可作為與禽流感抗病相關的候選基因，也可作為提高雞流感抗病性的遺傳標記[17]?！颈狙芯壳腥朦c】由于雞MHCB-LβII基因的多態性的存在，使得MHC II類分子接納與遞呈抗原肽有一定的選擇性，導致不同基因型個體對同一抗原表現出免疫應答強弱的差異。而中醫藥自古講求用藥個體化，因此中藥多糖作為調節機體免疫的外源性抗原之一，根據機體遺傳變異的特性給予不同劑量的中藥多糖，對保障疫苗效力、增強動物機體免疫力及提高其存活率有著重要意義?！緮M解決的關鍵問題】試驗擬排除因MHCB-LβII基因多態性而導致的不同基因型個體免疫應答能力的差異，確定中藥復方多糖對蛋雞禽流感免疫效果的影響，為中草藥復方多糖在蛋雞重大動物疫病防治工作方面提供可靠的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 藥物

中藥復方多糖由石河子大學中獸醫學研究室提供。復方由當歸、黨參、川芎、熟地、山楂、何首烏、淫羊藿、麥冬、茯苓、補骨脂與黃芪11味中藥按一定配比組成，經水提-醇沉法得到中藥復方多糖粗提物后，再由AB-8大孔吸附樹脂吸附解吸附，最終得到質量百分比濃度為77.10%的精制復方多糖。用滅菌超純水將復方多糖配制成50 mg/mL(高劑量)、25 mg/mL(中劑量)、12.5 mg/mL(低劑量)3個質量濃度，4℃保存備用。

1.1.2 主要試劑

雞新城疫病毒(La Sota株)、傳染性支氣管炎病毒(M41株)二聯滅活疫苗，購自普萊柯生物工程股份有限公司；雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯活疫苗(La Sota 株+H120株)及雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株)均購自哈藥集團生物疫苗有限公司；禽流感二價滅活疫苗(H5N1 Re-6株+H9N2 Re-2株)、禽流感H9亞型血凝抑制試驗抗原、禽流感病毒H9亞型陽性血清均購自哈爾濱維科生物技術開發公司；禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗抗原(Re-6株)，青島易邦生物工程有限公司；禽流感H5亞型血凝抑制試驗陽性血清、SPF雞陰性血清均購自青島立見診斷技術發展中心。

1.2 方 法

1.2.1 試驗動物及分組

500羽1日齡京紅1號蛋雞，購自新疆昌吉市某孵化場。根據MHCB-LβII基因第2外顯子PCR-SSCP的檢測結果分組，再將各組分為高、中、低劑量中藥多糖組和空白對照組。分別于8日齡肌肉注射50、25、12.5 mg/mL的中藥復方多糖和生理鹽水，每只0.2 mL，連續注射7 d。

所用試驗雞1日齡馬立克疫苗噴霧免疫(于孵化場進行)，7日齡新、傳二聯活疫苗點眼免疫，21日齡新、傳二聯活疫苗點眼與新、傳二聯滅活苗肌注免疫，14日齡法氏囊疫苗滴口免疫，28日齡禽流感二聯滅活苗免疫。在相同條件下常規飼養，飼養條件、營養水平和飼養管理均一致，飼養期為7周，整個試驗期雞群健康狀況良好。

1.2.2 PCR-SSCP基因型檢測1.2.2.1 基因組DNA的提取

翅下靜脈采血0.2 mL/羽，置于肝素鈉抗凝采血管中搖勻，-20℃冷凍保存。用血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，-20℃保存備用。

1.2.2.2 引物設計與合成

根據GenBank中收錄的雞MHC B-LβⅡ基因序列(NO.M29763.1)，應用Oligo軟件設計引物，引物序列為：上游引物：5’-AAACCGACCGTCTGGCGTGCTA-3’，下游引物：5’-TTACCCCACGCCTGGCTGAT-3’，擴增片段238 bp，引物由華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.2.3 PCR擴增

1.2.2.4 PCR-SSCP分析及序列測定

取3 μL PCR產物加7 μL 變性上樣緩沖液(98%去離子甲酰胺、10 mmol /L EDTA (pH 8.0)、0.05%溴酚藍)，98℃變性10 min，變性結束后迅速置于冰上冰浴10 min。用10%聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Scr=29∶1)電泳檢測，300 V電壓預電泳10 min，120 V電泳14 h后，固定、銀染、顯色，判定基因型，拍照保存。各取3個不同基因型個體的PCR產物進行純化回收，送華大基因科技股份有限公司進行測序，對PCR-SSCP分型結果進一步驗證。

1.2.2.5 檢測項目

每組隨機抽取5只試驗雞，于27、35、42、49日齡翅下靜脈采集非抗凝血3 mL，37℃靜置1 h，分離血清，用微量血凝抑制試驗(HI)檢測血清中H5與H9亞型禽流感抗體效價。

1.3 數據處理

采用SPSS 17.0軟件對數據進行方差分析和多重比較，數據以“x±SD”表示。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

用所設計的引物對基因組DNA進行擴增，取所得PCR產物5 μL于2%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，擴增產物檢測結果表明，所設計引物的擴增結果較好，片段長度與預期238 bp大小一致，條帶清晰、無非特異性條帶，可直接進行SSCP分析。圖1

注：M，Trans DNA Marker I；1～7，MHCB-LβIIPCR擴增產物

Note: M, Trans DNA Marker I; 1-7, PCR products ofMHCB-LβII

圖1 MHC B-LβⅡ的PCR擴增結果
Fig.1 The PCR amplification results of MHC B-LβII

2.2 SSCP檢測

對所有DNA樣本的PCR產物進行SSCP多態性檢測，發現所擴增片段有3種基因型，分別定義為AA (103羽)、BB(266羽)和BC(131羽)。圖2

注：1、6、8、10：BC型；2、4、7、9：BB型；3、5：AA型

Note: 1、6、8、10:BCgenotype; 2、4、7、9:BBgenotype; 3、5;AAgenotype

圖2 部分試驗雞MHC B-LβⅡ基因型的PCR-SSCP檢測
Fig.2 PCR-SSCP detection of MHC B-LβⅡ genotype in partial hen

2.3 中藥復方多糖對不同MHC B-LβⅡ基因型H5亞型禽流感抗體效價的影響

研究表明，免疫前各劑量中藥復方多糖組H5N1 Re-6母源抗體平均效價高于對照組，且高劑量組AA和BC型雞血清H5N1母源抗體效價顯著高于對照組(P<0.05)。AA基因型雞中，免疫后7 d，高、中、低三個劑量組的H5亞型禽流感抗體效價均顯著高于對照組(P<0.05)；免疫后14～21 d，中藥復方多糖組的抗體效價略高于對照組，但無顯著性差異(P>0.05)。BB基因型雞中，高劑量和中劑量組的H5亞型禽流感抗體效價較高于對照組，但無顯著性差異(P>0.05)。BC基因型雞中，免疫后7 d，高劑量組顯著高于對照組(P<0.05)，而中、低劑量組僅略高于對照組，但無顯著性差異(P>0.05)；免疫后14 d，各組間無顯著差異(P>0.05)；免疫后21 d，高、中劑量組顯著高于對照組(P<0.05)，而低劑量組僅略高于對照組，但無顯著性差異(P>0.05)。表1

表1 中藥復方多糖下不同MHC B-LβⅡ基因型京紅1號蛋雞H5亞型禽流感抗體效價
Table 1 Effects of Chinese Herbal Compound Polysaccharides on Antibody titers of H5 Subtype Avian Influenza in Different MHC B-LβⅡ Genotypes of Jinghong 1 layer

log2

注：同基因型組中，同列數據不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

Notes:In the same genotype group,different lowercase lettters in the same column mean significant difference(P<0.05).The same as below

2.4 中藥復方多糖對不同MHC B-LβⅡ基因型雞H9亞型禽流感抗體效價的影響

研究表明，免疫前各劑量中藥復方多糖組H9N2母源抗體平均效價均高于對照組，且高劑量組AA和BC型雞血清H9N2母源抗體效價顯著高于對照組(P<0.05)。AA基因型雞中，免疫后7 d，高、中、低三個劑量組H9亞型禽流感抗體效價均略高于對照組，但無顯著性差異(P>0.05)；免疫后14 d，高、中劑量組抗體效價顯著高于對照組(P<0.05)，且提前一周達到7 log2；免疫后21 d，各組間無顯著差異。BB基因型雞中，除免疫后14 d中劑量組顯著高于對照組外(P<0.05)，其他日齡各劑量組抗體效價雖高于對照組，但無顯著性差異(P>0.05)。BC基因型雞中，高劑量組中母源抗體效價顯著高于空白對照組(P<0.05)，免疫后7 d，各劑量中藥復方多糖組均顯著高于對照組(P<0.05)；免疫后14 d，中劑量組顯著高于對照組(P<0.05)，高、低劑量組略高于對照組，但無顯著性差異(P>0.05)；免疫后21 d，高劑量組顯著高于對照組(P<0.05)，中、低劑量組略高于對照組，但無顯著性差異(P>0.05)。表2

表2 中藥復方多糖下不同MHC B-LβⅡ基因型京紅1號蛋雞H9亞型禽流感抗體效價
Table 2 Effects of Chinese Herbal Compound Polysaccharides on Antibody titers of H9 Subtype Avian Influenza in Different MHC B-LβⅡ Genotypes of Jinghong 1 layer

log2

3 討 論

3.1 MHC B-LβⅡ基因多態性與蛋雞禽流感抗體效價的關聯性

由于MHC 分子的生物特異性和高度多態性，MHC B-L基因常被作為研究雞抗病能力的候選基因。吳春梅等[18]分析 MHC B-F區基因外顯子2的多態性與免疫性狀的相關性時，在來航蛋雞與北京油雞群體中均發現了多個SNPs位點與AI和ND抗體滴度相關，說明 MHC B-F 區基因外顯子2與AI和ND抗原的抗體產生有著較強的相關性。劉立波等[19]研究了雞MHC B-Lexon2基因多態性和血清AI抗體滴度相關性，結果表明與AI抗體滴度相關的SNP位點有多個，且有多種優勢單倍型。研究對京紅一號蛋雞MHC B-LβⅡ基因的多態性與蛋雞H5與H9亞型禽流感抗體效價進行了關聯分析，發現在免疫后7 d，H5與H9抗體在AA型組比BB和BC型組產生速度較快，而隨著免疫時間的增長，BB和BC型組抗體效價產生的速度快于AA型組；在免疫后21 d， H9亞型禽流感抗體效價在BB型組的顯著高于AA和BC型組，而H5亞型禽流感抗體效價在三個基因型組間并無顯著差異，這提示MHC B-LβⅡ基因多態性與機體產生禽流感H5與H9抗體的能力可能具有一定的相關性，MHC B-Lβ Ⅱ基因的多態性會引起機體對禽流感疫苗產生免疫應答能力的個體差異。

3.2 中藥復方多糖對不同MHC B-LβⅡ基因型蛋雞禽流感抗體效價的影響

近年來許多研究發現，中藥多糖，特別是由補益類中草藥中提取的多糖具有增強機體免疫能力，從而提高機體抗病力的作用?？贵w效價是監測機體免疫狀況、抗感染能力的一項重要指標，一般機體抗體效價的高低可以直接地反應機體體液免疫的強弱。劉永華等[20]研究表明，一定范圍內的高劑量牛膝多糖能夠提高雛雞的禽流感抗體滴度，對雛雞禽流感免疫有一定的促進作用。劉昭等[21]在雛雞飼料中添加不同劑量的生地提取物，連續給藥一周，結果發現不同劑量的生地提取物均可有效增強H9亞型禽流感疫苗的免疫效果，且以中劑量效果最佳。李星艷等[22]在研究復方中藥多糖、黃芪多糖、當歸多糖、淫羊藿多糖對禽流感抗體效價的影響時，發現復方中藥多糖可提高雛雞H5亞型禽流感抗體效價，且效果優于其它單味藥多糖組。研究結果顯示，與對照組相比不同劑量的中藥復方多糖均能提高各基因型組蛋雞血清中H5和H9亞型禽流感抗體效價，且對H9亞型的敏感度要優于H5亞型，與劉昭和李星艷等結果一致。與此同時，試驗發現除同一時間同一劑量中藥復方多糖對不同基因型的兩種抗體效價影響不同外，同一時間不同劑量中藥復方多糖對同一基因型的兩種抗體效價影響也不相同。其中，在免疫后7 d，高、中、低三個劑量的復方多糖均可顯著提高AA型組的H9亞型禽流感抗體效價與BC基因型組的H5亞型禽流感抗體效價，而對BB基因型組的H5和H9亞型禽流感抗體效價雖均有提高，但并無統計學差異。在免疫后14 d，高劑量中藥復方多糖能夠顯著提高AA型組的H9亞型禽流感抗體效價，中劑量中藥復方多糖能夠顯著提高AA、BB和BC型組的H9亞型禽流感抗體效價，高、中、低三個劑量的復方多糖對AA、BB和BC三個基因型的H5亞型禽流感抗體效價雖均有提高，但并無統計學差異。出現這一現象的可能原因是MHC B-LβⅡ基因多態性使機體存在免疫應答能力的個體差異，導致同一時間段內中藥復方多糖對提高機體血清中AI抗體效價的最適基因型不同；另一方面可能是由于不同MHC B-LβⅡ基因型雞的免疫調節系統對中藥復方多糖這種外來抗原在數量與濃度上存在敏感性的差異，過高或過低的中藥多糖均不會產生較好的免疫應答，從而引起抗體效價的差異；另外，可能也與中藥復方多糖在機體內的代謝過程有關，在此過程中多糖被降解成寡糖、低聚糖等小分子形式被MHC class Ⅱ類分子提呈給T細胞而發揮免疫效應，多糖濃度的不同與機體對多糖降解、吸收和代謝速度的不同，多糖在體內被降解成小分子糖的種類和數量的不同，以及不同機體MHC classⅡ類分子提呈多糖分子數量和能力的不同，這多方面的作用導致機體血清中AI抗體效價不同。

4 結 論

蛋雞MHC B-LβⅡ基因的多態性與機體產生禽流感抗體效價的能力可能具有一定的相關性，它能引起機體對禽流感疫苗產生免疫應答能力的個體差異。通過對不同MHC B-LβⅡ基因型雞H5及H9亞型禽流感抗體效價變化的比較，證明了肌注不同劑量的中藥復方多糖可以不同程度的提高各基因型組蛋雞血清中H5和H9亞型禽流感抗體效價，但整體上對H9亞型的敏感度要優于H5亞型，且中劑量和高劑量中藥復方多糖的效果好。

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