傳統發酵乳制品中微生物多樣性研究

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(內蒙古農業大學，乳品生物技術與工程教育部重點實驗室農業部奶制品加工重點實驗室,內蒙古呼和浩特 010018)

我國是一個地域遼闊的多民族國家,擁有眾多具有獨特民族特色的傳統食品。傳統發酵乳制品作為這類食品的典型代表,其主要由微生物自然發酵各種動物乳而獲得,產品的主要發酵為乳酸[1]。我國部分地區居民早在2000多年前就有制作和食用發酵乳制品的習俗,加之不同的氣候環境、地理因素以及制作工藝的差異,使得傳統發酵乳制品中蘊藏的微生物多樣性極為豐富[2-3]。這些微生物對傳統發酵乳制品的風味、組織質地、穩定性等方面有很重要的影響[4-5]。

454焦磷酸測序因其具有效率高、通量高、準確率高等特點,被廣泛用于微生物多樣性的研究。之前也有一些基于該技術對傳統自然發酵乳制品如酸牛奶、酸馬奶和酸駝奶中細菌多樣性的研究報道,但這些研究大多集中于探究傳統發酵乳制品中乳酸菌的生物多樣性[6-8],而對傳統乳制品真菌多樣性的研究相對較少。此外,這些研究大多僅停留在微生物多樣性的揭示,缺乏對核心菌群及其相關關系的深入探究。全面分析傳統發酵乳制品的生物多樣性、共有菌群以及共有菌群間相關關系,對于掌握傳統發酵乳制品風味物質的產生及變化規律、優化這類產品的生產工藝、實現產品標準化和工業化生產以及科學地篩選開發具有優良品質的工業發酵劑具有重要意義。

本研究基于上述背景,通過454焦磷酸測序技術高通量測序技術對采集自我國新疆地區的酸牛奶、酸馬奶和酸駝奶三份樣品中微生物多樣性、豐度、核心菌群以及核心菌群之間的相關關系進行分析。以期了解傳統不同地區和不同類型發酵乳制品中的微生物多樣性,為標準化和工業化生產傳統發酵乳制品提供數據支持,同時對于開發適合不同發酵乳制品的工業發酵劑提供有意參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

樣品 本研究從新疆自治區特克斯鎮一大隊局馬洪(奇勒烏澤克鄉)牧民家中,分別采集了牧民使用傳統發酵手段制備的酸牛奶、酸馬奶和酸駝奶樣品各一份。將樣品放置于有冰袋的冷藏箱內迅速運回實驗室,并置于-80 ℃冰箱冷藏備用。

5810R型冷凍離心機 德國Eppendorf公司;GDS-8000型凝膠成像儀 美國UVP公司;DYY-12型電泳儀 北京六一公司;PTC-200型梯度PCR擴增儀 美國伯樂公司;2100型生物分析儀 美國安捷倫公司;RocheGSFLX型測序儀 美國Roche454公司;ND-2000C微量紫外分光光度計 美國Nano Drop公司;OMEGA DNA isolation kit(D5625-01)試劑盒 美國OMEGA公司。

1.2實驗方法

1.2.1 樣品DNA提取及PCR擴增 使用OMEGA DNA isolation kit(D5625-01)試劑盒提取微生物宏基因組,完整度(瓊脂糖凝膠電泳結果在500 bp處有單一明亮條帶)、純度(OD260/OD280在1.8～2.0之間)及濃度(在10～20 μg之間)均滿足后續實驗要求的DNA樣品暫存到-20 ℃冰箱備用。

PCR擴增體系:10×PCR緩沖液2.5 μL,10 mmol/L dNTPs mix 2 μL,正向引物1 μL,反向引物1 μL,5 U/μL DNA聚合酶0.3 μL,模板DNA 1 μL,體系用去離子水補充至25 μL。

細菌16S rRNA V1-V3區正向引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′),其反向引物為533R(5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′)。真菌18S rRNA正向引物3NDF(5′-GGCAAGT CTGGTGCCAG-3′);其反向引物為(5′-ACGGTATCT(AG)ATC(AG)TCTTCG-3′)且在正向引物中加入7個核苷酸標簽(barcode)。

擴增條件為:首先94 ℃預變性5 min,然后94 ℃變性1 min,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min后重復30個循環,最后72 ℃延伸10 min。擴增產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳檢驗合格后,PCR產物置-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 454焦磷酸測序 通過產物純化、安捷倫2100生物分析儀定量混勻,上樣測序。焦磷酸測序按照 454 Roche GS-FLX的標準流程進行測試。

1.2.3 序列優化及質控 454測序得到的數據確認引物位置后,認為兩端引物之間的片段為可變區,篩選可變區長度大于300 bp的序列。根據樣本barcode編號進行篩選,必須為首7位且不允許錯配。控制整條序列上質量得分大于20的堿基所占比例高于93%。

1.2.4 生物信息學分析 通過QIIME(v1.7.0)分析平臺對進行過質量控制的序列進行物種豐度和多樣性分析,主要的操作步驟如下:

通過PyNAST對序列進行校準排齊,在序列100%相似性下進行UCLUST歸并,建立無重復的16S rRNA序列集;

在給定相似度97%水平上進行分類操作單元(Operational taxonomic units,OTU)劃分;

通過ChimeraSlayer檢測屬于嵌合體的OTU,隨后去除;

將OTU代表性序列通過RDP(Ribosomal Database Project,Release 11.5)和Greengenes(Release 13.8)數據庫進行同源性比對,整合兩個數據庫的比對結果,確定每個OTU最終的分類學地位;

使用FastTree軟件繪制基于OTU代表性序列的系統發育進化樹,并計算樣品的α和β多樣性。

1.2.5 多元統計學分析 對傳統發酵乳制品中核心細菌和真菌的豐富度指標、多樣性指標和基于屬分類地位的細菌和真菌相對含量進行相關性分析。通過Origin 8.5軟件和R軟件(v3.3.2)對QIIME產生的結果進行數據分析和數據可視化處理。

1.2.6 核酸登錄號 本研究中所有序列數據已提交至MG-RAST數據庫,項目ID號為mgp79277。

2 結果與分析

2.1樣品中細菌分析

2.1.1 細菌的豐度和多樣性分析 通過454焦磷酸高通量測序,分別獲得7367條、15303條和11748條酸牛奶、酸馬奶和酸駝奶樣品高質量細菌序列。三份傳統發酵乳制品樣品細菌的稀疏曲線(圖1A)和香農指數曲線(圖1B)如圖1所示。由圖1A可知,隨著測序深度的增加發現物種的數量也隨之增加,但與此同時每個樣品的shannon曲線已進入平臺期。由此可知,雖然隨著測序量的增加有可能會發現新的細菌種系型,但樣品細菌的多樣性已經不再隨測序量的增加而發生變化。因此本研究細菌測序量滿足后續生物信息學分析的要求。

圖1 3份傳統發酵乳制品樣品中細菌的稀疏曲線(A)和香農指數(B)Fig.1 Rarefaction analysis(A)and shannon diversity(B) estimates in bacteria from three traditional fermented dairy products samples

進一步分析發現,酸牛奶、酸馬奶和酸駝奶樣品分別得到了86個、24個和134個細菌OTUs。與此同時,三份傳統發酵乳制品樣品的chao1指數分別為136.18、31.94和208.82,simpson指數分別為0.62、0.32和0.82,shannon指數分別為2.37、0.77和3.51。上述結果表明,在微生物豐度和多樣性方面酸駝奶高于酸牛奶和酸馬奶、酸馬奶高于酸牛奶。造成該結果的原因可能是三種傳統發酵乳制品原料中蛋白質、VA、Fe、Ca、VB2含量在鮮駝奶、鮮牛奶和鮮馬奶中依次降低[9],其原料乳營養成分的不同可能導致了菌群多樣性和豐度的不同。

2.1.2 細菌OTU水平上三份傳統發酵乳制品樣品菌群分析 為了研究三份不同傳統發酵乳制品中細菌菌群的共性和差異,本研究在OTU水平上繪制了3份樣品細菌OTUs的Venn(維恩)圖,如圖2所示。三份傳統發酵乳制品中,共有的OTUs為6個,包含24777條序列,占全部序列(共計34688條序列)的71.4%。酸牛奶與酸駝奶樣品共享26個OTUs,其中包含28110條序列,占全部序列的81.0%。酸馬奶樣品與酸駝奶樣品共享14個OTUs,其中包含25084條序列,占全部序列的72.3%。酸牛奶樣品、酸馬奶樣品與酸駝奶樣品,分別擁有59個、9個和99個獨有OTUs,分別包含5143、16和1112條獨有序列,分別占全部序列(共計34688條序列)的14.8%、0.05%、3.2%。上述結果顯示,三份傳統發酵乳制品共有的OTU個數雖然少,但是擁有大量的序列數。該結果表明,在三份傳統發酵乳制品中存在一部分具有大量序列的共有OTUs。

圖2 基于OTU水平對三種傳統發酵乳制品菌群分析Fig.2 Based on OTU levels of three types of traditional fermented dairy products bacteria flora analysis

2.1.3 樣品中細菌相對含量的比較分析 對樣品中的細菌相對含量進行分析,結果發現酸牛奶中細菌分別由Firmicutes(89.79%)、Proteobacteria(9.22%)、Bacteroidetes(0.55%)、Actinobacteria(0.39%)和Deinococcus-Thermus(0.05%)5個菌門組成。酸馬奶中細菌分屬Firmicutes(99.98%)、Proteobacteria(0.01%)和Bacteroidetes(0.01%)3個菌門。酸駝奶中細菌分別由Firmicutes(82.94%)、Proteobacteria(16.73%)、Bacteroidetes(0.19%)、Actinobacteria(0.12%)、Acidobacteri(0.01%)和Fusobacteria(0.01%)組成。由圖3可知,三份傳統發酵乳制品均主要以Firmicutes為主。

圖3 3份傳統乳制品樣品中的細菌組成Fig.3 Compositions of bacteria in three traditional dairy products

如圖3 所示,在屬水平上酸牛奶樣品中的細菌主要由Lactococcus、Leuconostoc、Kluyvera、Lactobacillus和Weissella組成,其相對含量分別為66.78%、15.19%、8.34%、4.84%和1.90%。酸馬奶樣品中的細菌以Lactobacillus為主,其相對含量為99.93%。酸駝奶樣品中大于1%的細菌屬有Lactobacillus、Lactococcus、Leuconostoc、Acetobacter、Streptococcus、Citrobacter、Pseudomonas和Shigella,其相對含量分別為53.72%、18.72%、6.44%、6.09%、3.94%、3.72%、2.38%和1.51%。由此可見,Lactobacillus是酸馬奶和酸駝奶中的主要優勢細菌屬,發酵酸牛奶中Lactococcus為主要優勢細菌屬。值得一提的是,本研究還從酸馬奶樣品中檢測到有害菌屬——志賀菌屬。該菌屬的存在可能與自然發酵的開放狀態和傳統制作工藝的粗放操作有關,預示著傳統家庭作坊式的乳制品制作工藝可能存在的潛在安全問題。但由于本研究樣本數較少,有害菌屬的來源仍需進一步實驗進行驗證。

Oki 等以焦磷酸測序技術,對蒙古國6個地區的53份傳統發酵乳中細菌多樣性進行了分析,得到3 個門21 個細菌屬,其中屬Lactobacillus為優勢菌屬[10]。Xu等和Liu等采用同樣的技術分別對中國新疆和中國西藏地區的傳統發酵乳制品中的乳酸菌多樣性進行了分析,其結果均顯示Firmicutes為絕對優勢細菌門Lactobacillus為絕對優勢菌屬[11-12]。而包秋華等以純培養和DGGE技術對四川發酵酸牦牛奶制品曲拉進行乳酸菌多樣性分析,研究發現乳桿菌屬為優勢屬[13]。呼斯楞等以純培養和16S rRNA基因序列分析法對內蒙古呼倫貝爾地區傳統發酵乳中的乳酸菌進行多樣性分析,得到Lactococcuslactissubsp.lactis為內蒙古呼倫貝爾地區傳統發酵乳制品的優勢菌種占總分離株的25%,其次為Lactobacillusparacasei,占總分離株的20.83%[14]。

以上結果與本實驗結果相近,均表明在傳統發酵乳制品中存在豐富的細菌多樣性。牛奶、馬奶和駝奶的營養成分存在差異,不同營養成分導可能致了乳制品中菌群結構存在差異[15]。在三份傳統發酵乳制品中,酸駝奶樣品的微生物菌群組成相較于其余兩種傳統發酵乳制品樣品的微生物群落更加復雜。而酸馬奶的微生物菌群組成在三份傳統發酵乳制品中相對簡單。

2.2樣品中真菌分析

2.2.1 真菌豐度和多樣性分析 酸牛奶、酸馬奶和酸駝奶樣品經過測序后分別得到4375條、7599條和5360條高質量真菌序列,經過OTU劃歸后分別得到了41個、21個和11個OTUs。三份傳統發酵乳制品樣品真菌的chao1 指數分別為26.59、11.09和49.94,simpson指數分別為0.48、0.28和0.75,shannon指數分別為1.31、0.95和2.65。樣品的真菌的稀疏曲線和香農指數如圖4所示。其結果與細菌結果相似,隨著測序測序深度的增加本研究將獲得真菌的物種數量也隨之增加,但與此同時每個樣品的shannon曲線已進入平臺期。雖然隨著測序量的增加新的真菌種系將從樣品中被發現,但樣品真菌的多樣性已經不再隨測序量的增加而發生變化。因此本研究的真菌的測序量亦滿足后續的生物信息學分析要求。

圖4 3份傳統發酵乳制品樣品中真菌的香農指數圖(A)和稀疏曲線(B)Fig.4 Shannon diversity estimates(B)and rarefaction analysis(A) in fungi from three traditional fermented dairy products samples

2.2.2 基于OTU水平對三份傳統乳制品樣品菌群分析 為了研究三種不同傳統發酵乳制品中證明菌群的共性和差異,本研究在OTU水平上繪制了三份樣品真菌OTU水平的Venn圖,其結果如圖5所示。可以看出三份樣品包含的244個OTUs,其中包含17334條序列。其中,三份樣品共有的OTU為5個,其中包含13936條序列,占全部序列的80.4%。酸牛奶樣品與酸馬奶樣品共享7個OTUs,其中包含16028條序列,占全部序列的92.5%。酸牛奶樣品與酸駝奶樣品共享9個OTUs,其中包含14210條序列,占全部序列的82.0%。酸馬奶樣品與酸駝奶樣品共享6個OTUs,其中包含14065條序列,占全部序列的81.1%。酸牛奶樣品、酸馬奶樣品與酸駝奶樣品,分別擁有30、12和1個獨有OTU,分別包含480、405和18條獨有序列,分別占樣品全部序列的2.8%、2.3%、0.1%。其結果與細菌OTU水平Venn圖結果相似,三份傳統發酵乳制品中共有的OTUs雖然數目較少,但包含整個序列中大部分的序列。而這部分共有的OTU可能是傳統發酵乳制品中核心菌群。

圖5 基于OTU水平對三種傳統發酵乳制品菌群分析Fig.5 Based on OTU levels of three types of traditional fermented dairy products

2.2.3 樣品中真菌含量的比較分析 傳統發酵乳制品中真菌的多樣性及群落結構明顯低于細菌的多樣性和群落結構。酸牛奶樣品和酸駝奶樣品中均包含Ascomycota和Basidiomycota2個真菌門,其相對含量分別為98.83%、0.11%和99.98%、0.02%。酸馬奶樣品只含有Ascomycota。由此可知Ascomycota為三份傳統發酵乳樣品的優勢真菌菌門。據報道,Ascomycota也是韓國酒精飲料(Korean alcoholic beverages)、可可豆(Coco bean)、發酵白酒(Chinese liquor)的優勢菌門,于此同時Ascomycota是真菌界中種類最多的一個門[16-17]。

如圖6 所示,從酸牛奶樣品中共發現17 個真菌屬,其中優勢真菌屬分別為Galactomyces、Gibberella、Vanderwaltozyma、Wickerhamomyce、Dipodascus,其含量分別為39.36%、37.10%、8.59%、6.33%、5.17%、1.28%和1.23%。酸馬奶樣品中共發現6個真菌屬,其中優勢真菌屬分別為Vanderwaltozyma和Dipodascus,其相對含量分別為69.43%和30.00%。酸駝奶樣品中共發現7個真菌屬,其中優勢真菌屬分別為耐堿酵母屬Galactomyces、Vanderwaltozyma、Gibberella,其相對含量分別為84.57%、9.24%和2.72%。Galactomyces是酸牛奶和酸駝奶樣品的優勢真菌屬,酸馬奶的優勢真菌屬為Vanderwaltozyma。

圖6 3份傳統乳制品樣品中的真菌組成Fig.6 Compositions of fungus in threetraditional fermented dairy products

孫志宏等以焦磷酸測序技術,對西藏牦牛奶樣品進行生物多樣性分析,其研究結果發現Galactomyces為優勢菌屬[18]。烏仁圖雅以同樣的方法對內蒙古多部地區的酸牦牛奶的生物多樣性進行了分析,其中優勢真菌門為Ascomycota、優勢真菌屬為Galactomyces[19]。而張冬蕾以焦磷酸測序技術,對新疆22份傳統發酵乳制品進行生物多樣性分析,結果顯示其優勢菌門為Ascomycota、優勢真菌屬為Saccharomyces[20]。上述結果與本實驗結果一致,其均證明不同發酵類型的傳統發酵乳制品菌群構成存在一定的差異。其結果可能是導致傳統發酵乳制品口感豐富的原因之一。

2.3共有菌群中細菌與真菌相關關系

圖2和圖5的結果表明,三份傳統發酵樣品共享的OTU數目雖少,但包含的序列數卻很多,這部分OTU所代表的微生物類群有可能是傳統發酵乳樣品的“核心微生物群”。此外,每份樣品還有一定數量獨有的OTU,但這部分OTU包含的序列數相對較少。這進一步說明,傳統發酵乳制品中主要優勢菌種始終存在,而由于發酵乳原料不同以及加工手段不同會使得一些低豐度的物種存在一定差異。

為探究三份發酵乳中核心發酵菌群中細菌與真菌的相關關系,本研究從三份樣品中均含有的菌群出發,根據菌群相對含量利用R軟件計算其相關性,結果如圖7所示。結果顯示,Lactococcus與Galactomyces、Lactococcus與Leuconostoc的相對含量存在顯著負相關(p<0.05),而Leuconostoc與Galactomyces、Gibberella與Prevotella的相對含量存在顯著正相關(p<0.05)。

據報道在發酵乳制品中,Leuconostoc與真菌或細菌真菌共生體共同參與發酵乳制品的發酵過程[21]。因此在三份乳制品中,Leuconostoc與Galactomyces可能存在互利共生關系,導致其相對含量存在顯著正相關。而酵母菌據報道在促進微生物的共生作用、CO2的形成、提高特殊風味和香氣起著重要作用[22]。據報道,酵母菌可以分泌脂肪酶,分解脂肪形成游離脂肪酸抑制了乳球菌屬的生長;與此同時,乳酸菌產生的苯乳酸、4-羥基-苯乳酸和環肽抑制了酵母菌的生長,其可能是導致Lactococcus與Galactomyces的相對含量呈現顯著負相關的原因[23]。但由于本實驗的樣本數較少,確定發酵乳中細菌和真菌相互作用機理需要進一步實驗進行驗證。

圖7 3份傳統乳制品樣品中的真菌與細菌的相關關系Fig.7 The correlation between fungi and bacteria in three traditional fermented dairy products

3 結論

本研究采用高通量454焦磷酸測序技術,對從新疆奇勒烏澤克鄉同一牧區采集的三份傳統發酵酸牛奶、酸馬奶和酸駝奶樣品中的微生物多樣性、核心菌群及核心菌群間的相關關系進行分析。結果發現發現,酸牛奶、酸馬奶和酸駝奶樣品中的優勢細菌屬分別為Lactococcus、Lactobacillus和Lactobacillus,優勢真菌屬依次為Galactomyces、Vanderwaltozyma和Galactomyces。三份傳統發酵乳中存在相似的優勢菌屬,但其菌群結構存在差異。在三份傳統發酵樣品中存在共有微生物群。且共有菌群中Lactococcus與Galactomyces、Lactococcus與Leuconostoc的相對含量存在顯著負相關(p<0.05),而Leuconostoc與Galactomyces、Gibberella與Prevotella的相對含量存在顯著正相關(p<0.05)。上述研究成果為工業發酵劑的研發,以及進一步對傳統發酵乳制品中的菌群構成、核心菌群及核心菌群間相關關系的研究有一定參考價值。

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