I型遺傳性酪氨酸血癥動物模型研究進展

顧 鵬，劉 聞，袁 進，徐名襯，陳傍柱，徐 濤，顧為望*

(1.南方醫科大學比較醫學研究所暨實驗動物中心，廣州 510515；2.東莞松山湖明珠實驗動物科技有限公司，廣東 東莞 523808)

I型遺傳性酪氨酸血癥(HT1)是一種常染色體隱形遺傳病，臨床上主要變現為嚴重的肝、腎損傷，甚至肝癌[1]。HT1患者肝中基因表達的改變是導致該病發病的原因，通過基因表達分析可以更好地了解該疾病的具體發病機制。然而，受到倫理道德的限制，很多研究無法直接在人體中進行，必須首先依靠動物模型進行廣泛的實驗評估和論證。因此，建立可靠地實驗動物模型將更有助研究人員認識該疾病本質及其相關的治療方法。為此，本文對I型遺傳性酪氨酸血癥動物模型的相關研究進展進行綜述和探討，為更好的研究該疾病提供一些線索。

1 I型遺傳性酪氨酸血癥臨床表現及致病機制

I型遺傳性酪氨酸血癥又稱肝腎性酪氨酸血癥，總體患病約為1/2000～1/100000[2-3]。根據I型遺傳性酪氨酸血癥患者發病年齡，臨床上將該疾病分為急性型(發病年齡 < 2個月)、亞急性型(發病年齡2～6個月)和慢性型(發病年齡 > 6個月)[4]。急性患兒多在出生后2個月內急性發病，病情迅速惡化，常在出生后第3～9月死于肝功能衰竭[5-6]。亞急性型與急性型相似，但癥狀出現在出生后2～6個月之間。慢性型發病時間通常在出生6個月之后，臨床表現以漸進性肝和腎損害為主，隨著病情的發展最終會導致肝硬化和Fanconi綜合征，甚至出現佝僂病[7]。I型遺傳性酪氨酸血癥(HT1)發病原因是由于患者體內缺乏延胡索酰乙酰乙酸水解酶所致。FAH酶是酪氨酸代謝分解途徑的最后一步所需的酶，可將延胡索酸乙酰乙酸(fumarylacetoacetate，FAA)水解為富馬酸酯(fumarate)和乙酰乙酸(acetoacetate)[8]。FAH酶缺乏會導致有毒代謝物的積累，包括延胡索酰乙酰乙酸(FAA)和馬來酸乙酰乙酸(maleylacetoacetate)。由于其上游代謝物酪氨酸(tyrosine)、4-羥基苯丙酮酸(4-hydroxyphenylpyruvate)含量升高，使中間代謝產物馬來酰乙酰乙酸進一步積累，從而刺激產生旁代謝通路，導致其代謝產物琥珀酰乙酰乙酸(succinylacetoacetate)、琥珀酰丙酮增高(succinylacetone, SA)[9]。這兩種旁代謝產物可以與蛋白質的巰基結合，是造成肝、腎損害的主要原因。當不接受治療時，大多數HT1患者在嬰兒早期就會死于急性嚴重肝腎功能衰竭[7]。

2 I型遺傳性酪氨酸血癥小鼠模型

FAH基因在哺乳動物中非常保守，人、豬、大鼠和小鼠的cDNA(80%同源性)及蛋白質(94%同源性)均有著高度同源性[6]。Fah基因缺陷小鼠最先報導作為研究人類HT1疾病的動物模型并可以通過尼替西農(NTBC)給藥進行維持治療。停藥后，該小鼠會發生漸進性肝衰竭和腎小管功能障礙。

1979年Gluecksohn、Russell等[10-11]報導了c14CoS小鼠，該小鼠由于輻射造成了7號染色體大片段的刪除。純合的c14CoS小鼠在出生后數小時內死亡同時伴有嚴重的肝損傷。研究發現，該小鼠體內許多肝特異性酶都有減少甚至消失，包括酪氨酸氨基轉移酶(Tat)[12]、葡萄糖-6-磷酸酶(G-6P)[10]、谷氨酰胺合成酶(Gs)[9]、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(Pepck)[13]、醛縮酶B和血清白蛋白[14-15]等。相反，導致肝損傷的mRNA水平(Chop-1、Nmo-1)則都有上升[16-17]。肝、腎組織學上的損傷在c14CoS小鼠也有發現。但是，由于該小鼠的突變類型是大片段的基因刪除，導致例如酪氨酸激酶在內的很多基因也被刪除了，因此與人類HT1患者的基因型表現存在一定的差異性。

1993年Grompe等[18]通過同源重組技術將小鼠Fah基因5號外顯子刪除，成功制備了Fah基因敲除小鼠(FahΔexon5mouse)并顯示出與c14CoS小鼠完全相同的表型。此后Overturf (1996)、Paulk (2010)、Lisowski (2012)、Huang(2011)、Zhu(2014)等先后制備了Fah基因敲除的小鼠模型[19-23]。Fah基因敲除小鼠往往會在新生仔鼠出生后1周內死于嚴重肝損傷，但是通過在水中添加NTBC可以有效改善肝的損傷。NTBC撤藥后若繼續給予正常蛋白質含量的飲食將會導致嚴重的肝、腎疾病，通常6周后即會死亡[24]。目前，Fah-/-小鼠已經成為研究I型遺傳性酪氨酸血癥理想的動物模型。2001年Aponte等[25]人通過ENU誘導制備了Fah基因點突變小鼠。這種單一堿基改變擾亂了核苷酸的剪接并產生一個編碼無效蛋白質的等位基因。因此，該小鼠生化表型與其他Fah-/-突變動物一樣[20]。

2007年，Azuma等[26]將Fah-/-小鼠和Rag2-/-/Il-2rg-/-小鼠雜交獲得FRG(Fah-/-/Rag2-/-/Il-2rg-/-)小鼠，這為之后將人肝細胞移植到免疫缺陷的Fah-/-小鼠上實現肝臟的人源化奠定了基礎。但該方法須要進行多次雜交和回交，費時費力。近年來興起的鋅指蛋白酶(ZFN)、TALEN、CRISPR/Cas9 等基因編輯技術可以直接在受精卵中進行基因編輯而受到廣泛關注。Winer 等[27]利用鋅指蛋白酶將NODRag1-/-/Il2rg-/-(NRG)小鼠受精卵的Fah基因5號外顯子敲除，獲得的小鼠與Fah-/-小鼠和NRG小鼠雜交得到的FRG小鼠相比，人源肝細胞再植率幾乎相同；Li等[28]應用CRISPR/Cas9技術也實現了NRG小鼠中Fah基因的敲除，而耗時僅需6周，相比于傳統方法操作更為簡單，耗時更短。盡管如此，Fah基因敲除小鼠模型無法反映HT1患者關鍵的慢性病變，即肝纖維化和肝硬化[29]。

3 I型遺傳性酪氨酸血癥大鼠模型

作為實驗動物模型，在各種生理和病理方面，大鼠比小鼠更接近人類。大鼠體重比小鼠大至少10倍，能夠提供的血液、膽汁酸、細胞和組織也更多，對于后續實驗分析更為有利[30]。

2016年Zhang等[30]通過CRISPR/Cas9技術成功制備了Fah基因敲除大鼠。Fah-/-大鼠在NTBC停止給藥后出現體重下降，進而死于漸進性肝衰竭等其他并發癥，表現出與人類HT1患者常見癥狀相似的特征。相比于Fah-/-基因敲除小鼠，Fah-/-大鼠在NTBC停藥后血清ALT，AST和TBIL水平更高，組織學分析也發現大量肝細胞死亡，這表明Fah-/-大鼠具有更嚴重的肝損傷現象[25,31]。此外，在NTBC停止給藥后，Fah-/-大鼠也檢測到腎小管損傷。與Fah基因突變小鼠不同，通過肝的宏觀變化，組織學分析和生化檢查發現Fah基因敲除的大鼠具有明顯的肝纖維化和肝硬化表型。

同年，Kuijk等[32]報導Fah-/-/Il2rg-/-大鼠模型可以用于評估體內大鼠肝干細胞的功能。同時也證明了大鼠肝干細胞系特別適用于研究人類代謝紊亂大鼠模型，例如Gunn大鼠(CN綜合征型I型)，Fah-/-模型(酪氨酸血癥型I型)，血色素沉著癥模型以及Long Evans Cinnamon大鼠(威爾森氏病的模型)[33-35]。受益于大鼠肝干細胞系，這些模型將作為潛在的工具進一步闡明這些疾病的分子機制以及檢查肝干細胞在移植后恢復肝功能的能力。

4 I型遺傳性酪氨酸血癥兔模型

目前，酪氨酸血癥I型小鼠和大鼠模型均已受到廣泛的重視和應用。但是受限于嚙齒類動物大小、體型、生理及遺傳發育等與人類的差異性，因此一定程度上不能完全反應人類HT1疾病的本質。實驗兔作為中等動物模型，生理結構、遺傳代謝以及發育上更加接近人類，且具有更長的壽命[36-37]。Fah-/-兔模型的建立可以為HT1肝損傷疾病的機理研究和治療提供更為可靠的模型。

2017年，Li等[38]通過TALENs基因打靶技術獲得了Fah雙等位基因敲除兔。Fah-/-基因敲除兔表現出HT1患者肝和腎損傷表型，但也有頻繁的眼部病變表型(主要是角膜炎)。這就使得其成為研究如何預防和治療HT1患者潛在并發眼部疾病良好的模型[39-40]。此外，從DNA水平、蛋白表達水平，血液生理生化水平以及病理變化等方面檢測結果顯示，與小鼠相比，Fah-/-兔更好的模擬了人類HT1疾病的表型。通過同種異體肝細胞移植發現，移植3個月后外源性肝細胞在Fah-/-兔模型肝臟中整合率達到80%，有效緩解了Fah-/-基因敲除兔的肝損傷，治療效果明顯[38]。

5 I型遺傳性酪氨酸血癥小型豬模型

小型豬體型大小、生理學、疾病發展等方面與人相似性更大，是生物醫學研究中理想的實驗動物模型，在探究人類疾病的預防措施、致病機制、治療效果、藥物篩選以及探索人類生命活動規律等方面均更有優勢[41]。小型豬的解剖學特征比小型動物模型更接近人類，利用小型豬制備動物模型不僅更能模擬人類疾病的發生發展，而且手術操作更為宏觀簡單[42]。此外，小型豬器官的大小也使他們成為生產人類細胞、組織甚至異種器官移植最理想的選擇[43-44]。

2011年，Hickey等[29]通過腺相關病毒(AAV)和同源重組技術靶向破壞豬7號染色體Fah基因成功制備了Fah基因敲除雜合子豬(Fah+/-)。通過AAV載體打靶豬胎兒成纖維細胞5號外顯子，平均敲除效率達到5.4%。這些Fah基因敲除雜合子豬表型正常，具有良好的繁殖能力，突變的等位基因能夠穩定遺傳，同時肝臟病理學沒有任何異常。雖然是雜合敲除，但是Fah雜合子豬的FAH蛋白水平和水解延胡索酰乙酰乙酸(FAA)的能力顯著降低。2014年，Hickey等[45]將Fah基因敲除雜合子豬進行互交，成功培育了Fah-/-雙等位基因敲除純合子豬。研究發現，與HT1患者相似，如停止NTBC給藥時Fah-/-基因敲除純合子豬無法發育。其次，由于Fah酶缺乏，Fah-/-基因敲除純合子豬血液和尿液中酪氨酸和琥珀酰丙酮含量顯著上升。Fah酶缺陷導致延胡索酰乙酰乙酸(FAA)在細胞中積聚引起嚴重的肝損傷[46-47]。生化檢測發現血液中AST，堿性磷酸酶，氨和總膽紅素顯著上升，提示該豬有嚴重的肝損傷。除此以外，在NTBC撤藥后也檢測到腎小管損傷。2017年，該課題組通過降低NTBC維持給藥劑量后發現，Fah-/-豬表現出生長遲緩和生化異常，如轉氨酶升高，琥珀酰丙酮(SA)和甲胎蛋白(AFP)升高，并呈現出NTBC劑量依賴特征。隨后，FAH-/-豬出現了肝纖維化、肝硬化和門靜脈高壓等慢性肝病表型[48]。該模型證實了Fah-/-豬作為一種新型肝硬化大動物模型，可以應用于包括藥物開發和毒性測試以及評估現代成像等技術的研究。

6 總結與展望

最初，I型遺傳性酪氨酸血癥動物模型作為研究人類HT1疾病的病理生理以及治療效果的理想動物模型而開發。而目前，它們已經被廣泛應用于肝生物學、肝干細胞以及肝癌基因治療的研究，同時也可用于制備人源化肝以及作為人肝細胞擴增的生物反應器。除此以外，I型遺傳性酪氨酸血癥動物模型也可用于評估肝外源細胞移植，如骨髓或成人胰島細胞移植的療效。這將使它們成為研究I型遺傳性酪氨酸血癥致病機制以及評估最新發現的肝祖細胞和肝細胞樣細胞臨床前療效理想的模型。