化療相關性腹瀉動物模型構建的研究概述

吳夢雨，鄧 博，賈立群*

(1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.中日友好醫院，北京 100029)

化療相關性腹瀉(Chemotherapy-induced Diarrhea，CID)是腫瘤患者化療引起的一種常見消化道毒副反應。近年來化療藥物的廣泛應用，CID的發生率也在逐年提高。尤其是5-氟尿嘧啶(5-FU)持續靜脈滴注和伊立替康(Irinotecan, CPT-11)所致的遲發性腹瀉成為臨床治療的難點[1]。CID不僅會降低患者的生活質量，還會增加患者住院費用和治療時間,嚴重者還可能會導致水和電解質紊亂、脫水、感染等，化療被迫中斷，更甚者休克甚至危及生命[2]。與其他化療引起的消化道反應如惡心、嘔吐相比，CID的病理生理機制至今尚未完全清楚，其治療方案也不同于一般性腹瀉，因此開展CID的防治研究有極為重要的意義。良好的人類疾病動物模型是推動醫學研究發展的重要工具，在CID的相關研究及治療方法的探索上，一定程度上需要依賴動物模型得以實現，本文就國內外已開展的各種CID研究的動物模型構建方法進行綜述，以期為CID的預防、治療以及預后提供安全可靠的造模參考。

臨床上化療相關性腹瀉常表現為大便次數增多，出現軟便、稀便或水樣便，并伴有腹脹、胃脘疼痛、全身乏力等癥狀。美國國家癌癥研究所發布的不良事件術語標準[3]根據化療前后患者大便次數的增加情況對化療所致腹瀉嚴重程度進行評價和分級，但并未將糞便特征、伴隨癥狀等進行完整評估。動物實驗中常依照Kurita的方法[4]進行腹瀉程度評分(0分：大便正?；驔]有；1分：輕度腹瀉，大便輕微濕軟；2分：中度腹瀉，大便較濕且不成形，有輕度肛周著色；3分：重度腹瀉，水樣便并伴有重度肛周著色)，腹瀉評分的顯著差異是評價腹瀉模型的標準。

1 CID荷瘤動物模型

1.1 荷瘤小鼠模型

(1)CPT-11

Cheng等[5]為了驗證細菌β-G特異性抑制劑對化療藥物腸毒性的作用，以Balb/cJ(Balb/c ByJNarl)小鼠為受試對象，構建CID荷瘤小鼠模型。首先在小鼠右側脅部皮下注入CT26結腸癌細胞，待瘤體達10～50 mm3時(約9 d)開始灌胃。隨后連續10 d予CPT-11 50 mg/kg腹腔注射，制備腹瀉模型。結果末次化療后第7天，CPT-11組所有小鼠發生腹瀉，并有一半表現為嚴重腹瀉，而化合物灌胃組只有50%小鼠腹瀉，但兩組腫瘤生長情況無差異，表明該藥能抑制CPT-11誘導的腹瀉，并保持化療效果。Kong等[6]同樣構建了Balb/cJ小鼠CT26結腸癌模型后，予CPT-11 50 mg/kg腹腔注射連續12 d，在化療第7天時觀察到50%的小鼠出現腹瀉，第8天達到65%，第12天時皮膚糞便染色更深、液體更多。彭罡等[7]觀察中藥復方生姜瀉心湯對CPT-11導致的遲發性腹瀉的影響，選取雌性ICR小鼠，采用陳永康等[8]的方法，腹腔注射10 mg/kg AOM 1 d，2% DSS水飼養1周，然后正常飲水2周，連續4個周期，誘發小鼠結直腸癌。隨后連續4 d腹腔注射CPT-11 36.8 mg/kg，末次注射后觀察到模型組和生姜瀉心湯組均100%發生不同程度的腹瀉，且與正常對照組相比有顯著性差異，說明造模成功。Lam等[9]采用一次性注射給藥的方法，將小鼠結腸癌38細胞接種到雌性BDF1小鼠皮下，10～14 d待成瘤后一次性腹腔注射大劑量CPT-11 350 mg/kg，48 h開始出現顯著的體重下降和腹瀉，并可觀察到空腸粘膜結構的破壞。

(2)5-FU

5-FU一般采取一次性大劑量注射的方法造模，符彩選等[10]探討片仔癀對荷瘤小鼠5-FU所致毒副作用的影響，采用腫瘤細胞懸液接種法，于化療前接種于雄性Balb/c小鼠右前肢腋窩處皮下，建立CT26結腸癌移植瘤模型。成瘤后分組，5-FU組一次性腹腔注射5-FU 150 mg/kg?；熀罂梢?-FU組小鼠毛無光澤，反應遲鈍，腹瀉發生率100%。

1.2 荷瘤大鼠CID模型

(1)CPT-11

Gibson等在DA大鼠上復制乳腺癌模型[11-12]，之后化療組連續兩天接受CPT-11腹腔注射150 mg/kg，結果25%的大鼠在第一次注射后立即出現輕度腹瀉，2%進展為中度腹瀉。24 h后4%的大鼠出現嚴重腹瀉，48 h內增加到18%，72 h至40%，然后96 h下降到16%。

Xue等選擇特別適用于研究嚴重遲發性腹瀉和臨床相關劑量限制性毒性的Ward結腸腫瘤移植到雌性Fisher 344大鼠，并將大鼠分為四組分別尾靜脈注射不同劑量的CPT-11(75、100、125、150 mg/(kg·d)，連續3 d)以測定其最大耐受量[13-14]。結果表明125 mg/(kg·d)可誘導大鼠產生嚴重的遲發性腹瀉，且死亡率最低，腹瀉持續一周。而100 mg/(kg·d)腹瀉發生率低，150 mg/(kg·d)會造成43%的死亡率。

(2)5-FU+奧沙利鉑

5-FU+奧沙利鉑是廣泛用于治療結直腸癌的化療方案， Mi等[15]嘗試用多種方法制備結直腸癌模型動物模型，發現常見的化學致癌物質二甲基亞砜(DMH)誘導的實驗模型與臨床具有相似特征，但更耗時；皮下注射SW480細胞，腫瘤生長較快，但形成率低。因此其嘗試使用聯用的方法，即SD大鼠皮下注射DMH 10周，然后注射SW480細胞，在直腸黏膜建立模型，結果兩周腫瘤形成率達到96.67%。隨后采用5-FU 75 mg/kg+奧沙利鉑 8 mg/kg的化療方案連續3 d腹腔注射。實驗結束后，大鼠均無死亡，但化療組出現嚴重的體重下降和腹瀉。

(3) 達克替尼

達克替尼是一種口服、強效和具有選擇性的不可逆小分子抑制劑，用于攜帶EGFR激活突變的局部晚期或轉移性非小細胞肺癌患者的一線治療，其最常見的不良反應就是腹瀉，發生率可達73%[16]。Van Sebille等[17]探究其腹瀉的發生機制，選用荷瘤雄性Wistar大鼠，達克替尼7.5 mg/(kg·d)口服21 d，制備腹瀉模型，結果腹瀉(1～3級)發生率100%，與臨床試驗中的發病率相當，說明造模成功。

荷瘤的CID動物模型廣泛應用于各種治療CID的藥物以及各種化療藥物腸毒性機制的研究，以上方法被證實能夠有效模擬人體化療后腸毒性的發生發展過程，其制備方法值得借鑒。荷瘤模型能夠保證受試動物在腫瘤生長和化療腸毒性的反應上保持一致，同時可以驗證治療藥物是否促進腫瘤生長或干擾細胞毒性。但缺點是造模時間長、個體差異大、存活率難保證且花費大，導致研究受限。

2 非荷瘤模型

2.1 非荷瘤小鼠

(1)CPT-11

羅振濤等[18]參照Ikuno[19]的方法造模，選用雄性Balb/c小鼠，腹腔注射CPT-11 75 mg/kg，連續4 d，小鼠逐漸出現體重下降、精神萎靡、厭食等癥狀，4 d后，腹瀉率達100%，肛周皮膚粘膜紅腫，大便次數明顯增多，較濕且不成形，部分呈水樣便，腹瀉癥狀持續到實驗結束。上述模型已被國內外學者[20-24]反復多次應用于CID防治藥物的研究中，成模率較高，值得借鑒。另有國內的研究[25]選用雄性ICR小鼠尾靜脈注射CPT-11 35 mg/(kg·d)，連續4 d，末次注射24 h后，小鼠均出現不同程度的稀便、粘液便、肛周污穢。

(2)5-FU

5-FU所致腸毒性對腸粘膜屏障的損傷較重，易導致胃腸道粘膜炎(gastrointestinal mucositis，GIM)，包括嚴重的腹瀉、惡心、嘔吐和厭食等癥狀。Sakai等[26]]給予雄性C57BL/6腹腔注射50 mg/kg共4 d，可觀察到明顯的體重下降和腹瀉癥狀。Hamouda等[27]同樣選用雄性C57BL/6小鼠，化療延長至6 d，第5天開始出現嚴重的體重下降，平均體重下降至83.6；第3天開始出現廣泛腹瀉，第6天平均腹瀉評分2.8分；最后藥物引起嚴重的絨毛縮短、隱窩減少等腸粘膜炎特征。不同學者[28-30]通過評價各種生理指標和病理變化，分別在ICR小鼠、SD大鼠等不同動物中驗證了該造模方法的可行性，均可見到廣泛的腹瀉癥狀和腸粘膜炎癥狀，因此該方法可用于對化療粘膜炎性所致腹瀉的研究。

2.2 非荷瘤大鼠

(1)CPT-11

Trifan[31]等評估了CPT-11總劑量和分次劑量對大鼠腹瀉模型的影響。發現CPT-11注射總劑量越高，腹瀉越嚴重；但是另一方面，連續2 d尾靜脈注射CPT-11 150 mg/(kg·d)較連續4 d注射80 mg/(kg·d)腹瀉更重且死亡率更低。因此其采用150 mg/(kg·d)連續2 d注射的方法造模，末次注射48 h后出現遲發性腹瀉，72 h達到最嚴重，且沒有大鼠死亡。Deng等[32]采用同樣的方法造模，末次注射CPT-11 24 h后，大鼠出現不同程度的腹瀉、進食減少等表現，說明造模成功，但其中兩組分別有1只大鼠在化療過程中死亡。張程亮等[33]探究沙利度胺對CPT-11所致腹瀉的治療作用，采用60 mg/kg的CPT-11連續注射4 d制備大鼠腹瀉模型，大鼠體重明顯下降，給藥結束后第2天出現腹瀉癥狀，并在第4天達到高峰，隨后癥狀逐漸減輕，說明化療劑量的控制對于化療后腹瀉程度和死亡率的影響十分重要。

(2)5-FU

胃腸粘膜炎可能是引起CID的主要因素，其特征是吸收不均衡[34]。Eiichi等[35]選擇了足以誘導Wistar大鼠腸粘膜損傷但不足以致死的劑量，采用中心靜脈注射5-FU 100 mg/kg連續4 d(實驗共7 d)，大鼠從第4天開始表現嚴重的水樣腹瀉，并出現毛發豎立等膿毒癥樣癥狀；病理顯示空腸壁變薄甚至透明，粘膜下層疾病消失。該模型毒性反應較重，適用于對胃腸粘膜損傷的研究。Abalo等[36]制備Wistar大鼠CID模型，首先使用單一劑量5-FU 150 mg/kg腹腔注射，在給藥后4 d發現無法觀測到腹瀉的放射學征象。因此加用第2天150 mg/kg(累積劑量達300 mg/kg)，使累積劑量達到類似靜脈途徑和口服途徑，可以觀察到有效的腹瀉征象，適用于研究。

非荷瘤模型能夠排除其他混雜因素，單獨研究化療藥物對腹瀉和腸粘膜的毒性的影響，且造模方法簡便快速、價格低廉，復制成功率高，動物死亡率相對較低，可操作性強。在大鼠和小鼠的選擇上，大鼠體表面積大，所需的實驗成本相對較高，而小鼠具有成本低、生長快、易于大批繁殖、取材方便等優點，因此在貴重藥品或者毒性藥品易造成動物死亡的實驗中可考慮選用小鼠。

3 基因敲除動物模型

基因敲除動物是應用基因敲除技術和胚胎干細胞技術制作出來的在個體基因組特定位點上的目的基因被刪除或滅活的一類動物，其遺傳改變非常清楚，可以研究以前經典遺傳無法了解的基因表現型效應[37]。目前，基因敲除小鼠化療腸毒性模型應用日趨廣泛，5-FU是常見的造模藥物。Sezaki等[38]為研制Fn14基因敲除小鼠CID模型，采用雄性Balb/c野生型小鼠(WT)和Fn14基因敲除(Fn14KO)小鼠腹腔注射5-FU 250 mg/kg，各組均未見造模后死亡。野生型組小鼠5-FU給藥后第3天開始出現嚴重腹瀉，并在整個研究期間持續，而Fn14KO小鼠腹瀉較輕，表明Fn14表達增加化療誘導腹瀉和破壞TWIME/FN14途徑可能潛在地預防5-FU誘導的腹瀉。Sano等[39]為探究H2受體拮抗劑拉呋替丁通過TRPV1信號通路對腸粘膜的保護作用，選取雄性C57BL/6野生型(WT)和TRPV1基因敲除型(TRPV1KO)小鼠，腹腔注射50 mg/kg，連續6 d，制備CID模型，基因敲除的小鼠化療開始后體重明顯下降，并從第4天開始觀察到明顯的腹瀉，第6天平均腹瀉評分達3分。表明TRPV1信號為其誘導感覺傳入神經元必不可少的途徑。

基因敲除動物模型對于研究動物遺傳特性和疾病相關基因功能更有針對性，具有靶向性的特點。但其缺點在于，基因敲除小鼠的培育過程較為復雜和困難， 需要較高的技術要求，更加耗時、耗力，且成功率低；其次，研究所敲除的基因有可能是具有致命功能的基因，動物易在胚胎早期發生死亡，成活率低；并且如果被敲除的基因可被其他具有多功能的基因造成功能代償， 這樣便失去了基因敲除的意義，致使基因型改變變得模糊，無法得到可靠的研究結果。但是對于基因工程動物來說，作為功能基因的驗證工具，制作的前提是已有明確的科學假設，如確定的靶基因或通路，因此繁育困難的問題基本可以解決。隨著我國支持基礎研究的力度越來越大，生命科學領域的不斷發展，基因工程動物的應用會更加普遍、前景更加廣闊。

4 小結

由于不同的化療藥物所致的腹瀉有著不同的發生機制和病理基礎，因此其腹瀉癥狀和病理改變也不盡相同。目前臨床上常見的引起CID的藥物主要為CPT-11和5-FU，研究者需要明確研究目的和研究內容，選擇合適的動物?；熕幬锏氖褂蒙?，要考慮藥物種類、總劑量、給藥方法和次數，爭取達到最大程度的腹瀉發生，且動物死亡率低，可操作性強、易復制。構建實驗動物模型是間接反映人類疾病的手段和方法，是研究人類疾病發生發展的必要途徑，需符合實驗動物倫理要求，讓實驗動物最大程度的發揮其實驗作用，為相關人類疾病的研究和防治提供可靠的參考依據。