單克隆抗體純化方法比較論述

馬 莉 劉 雙，2

（1.新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊縣畜牧獸醫(yī)站，新疆烏魯木齊 830036；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830000）

單克隆抗體制備的理論基礎(chǔ)是F. Macfarlane Burnet的克隆選擇學(xué)說（1959）：每個(gè)哺乳動(dòng)物B淋巴細(xì)胞有特異性抗體的潛力。抗體鏈的恒定區(qū)域可能會(huì)改變?cè)诹馨图?xì)胞克隆的分化過程中，但可變區(qū)保留這種奇異的特異性。1975年Kohler和Milstein開發(fā)出一種能提高抗原表位的特異性抗體技術(shù)；這種技術(shù)被命名為雜交瘤技術(shù)，用這種方法生產(chǎn)的抗體稱為單克隆抗體。隨著單克隆抗體的廣泛應(yīng)用，其純化技術(shù)也在快速發(fā)展。本文將介紹幾種試用于中小規(guī)模的抗體純化方法，通過比較來選擇適合的方法。

1 抗體純化

1.1 沉淀法

沉淀法是利用不同蛋白質(zhì)疏水性的不同，提高鹽濃度，可是蛋白質(zhì)的疏水性增加，使其沉淀而分離。將30%～50%飽和硫酸銨（AS）加入到血清或者腹水中來沉淀抗體中的免疫球蛋白，通過離心分離沉淀與未沉淀的蛋白質(zhì)。當(dāng)重懸沉淀后，獲得的上清溶液即為富含抗體的液體。沉淀法的操作非常容易，成本廉價(jià)，適用于所有血清和腹水。但同時(shí)也存在不足，抗體的提純效果不高，而且不適用于單克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清的提純，有一定的局限性。

1.2 離子交換層析法

離子交換層析法（Ion exchange chromatography，IEC）使用最大的一個(gè)限制就是需要知道抗體的等電點(diǎn)（Isoelectric point，pI），很明顯，單克隆抗體的pI范圍較窄。所用的陰陽離子交換樹脂作用于單克隆抗體的效果要好于多克隆抗體。IEC最大的優(yōu)點(diǎn)是它能分離除去單克隆抗體中的蛋白質(zhì)A/G、DNA、逆轉(zhuǎn)錄病毒及內(nèi)毒素，所得的單克隆抗體純度可被認(rèn)為＞90%，并且適合大多數(shù)的抗體及亞型，這對(duì)于制備用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)的單克隆抗體具備很大價(jià)值。但對(duì)于其他的抗體純化效果就變異性很大，純化范圍在60%～95%。

1.3 分子篩層析法

分子篩層析法（Size exclusion chromatography，SEC）是一種較溫和的純化方法，它可用生理?xiàng)l件下的緩沖液將抗體在最適pH中進(jìn)行純化。生產(chǎn)所用的樹脂主要是在顆粒的孔徑度的數(shù)值上有所不同。待純化樣品中的大分子不進(jìn)入膠孔內(nèi)而先流出，過柱速度快于小分子；小分子流經(jīng)孔徑時(shí)被阻止而進(jìn)入基質(zhì)，所以后洗脫。生產(chǎn)所使用的柱子均較小，一次只能純化幾毫克的量，但使用SEC仍是增加抗體產(chǎn)品純度較有效的方法。

1.4 蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)G

蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)G均是細(xì)菌細(xì)胞壁的一個(gè)結(jié)構(gòu)組成，對(duì)免疫球蛋白的Fc區(qū)域有高度結(jié)合親和性。蛋白質(zhì)A依據(jù)這種特性能夠根據(jù)亞型來純化單克隆抗體。例如，小鼠的腹水含有自身免疫球蛋白（一般為IgG1和IgM）和雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體。蛋白質(zhì)A在低鹽條件下不結(jié)合IgM，與IgG1有微弱結(jié)合，因此，如果單克隆抗體的亞型是IgG2a、IgG2b或IgG3，那么便可獲得相對(duì)純凈的單克隆抗體。在高鹽（3 mol/L）結(jié)合緩沖液的條件下，蛋白質(zhì)A可成功用于純化IgG1，那么用小鼠為容器所制的單克隆抗體無法清除這些自身免疫球蛋白。

蛋白質(zhì)A/G是最好的抗體第一步純化方法，可進(jìn)行大樣本純化，但經(jīng)濟(jì)成本也相對(duì)要高得多。考慮到各個(gè)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況，可將蛋白質(zhì)A/G凝膠柱重復(fù)使用，但要注意若要用于不同抗體的純化，柱子需再生。

2 結(jié)語

抗體的最終用途將決定其被純化的方法。對(duì)于快捷廉價(jià)的純化，沉淀法足矣。但如果用于診斷，蛋白質(zhì)A/G純化的抗體能提供好的檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性。如果用于臨床前期研究，蛋白質(zhì)A/G純化的抗體再用IES、SES或疏水作用色譜法進(jìn)一步純化將得到高純度抗體。對(duì)于任何臨床前期和臨床應(yīng)用，抗體純化必須在無菌和低內(nèi)毒素的條件下進(jìn)行，必須符合當(dāng)?shù)氐姆ǘú僮鞒绦颉Ｒ虼藢?duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)室，每種抗體應(yīng)該確定一種純化策略，為抗體的生產(chǎn)提供更好更優(yōu)的條件。