酸性調寧蛋白的研究進展

雷 蕾，刀 慶，牛成慧，韓雁冰

(昆明醫科大學第一附屬醫院神經內科，昆明 650032)

調寧蛋白(calponin)是一種表達于平滑肌細胞及非肌細胞(神經元、成纖維細胞、人絨毛膜癌細胞等)中的調節蛋白，它們能與肌動蛋白結合，抑制由肌動蛋白激活的肌球蛋白ATP酶的活性，是一個分子量在34 × 103～ 37 × 103(292 ～ 330個氨基酸)的肌動蛋白家族。

1 調寧蛋白概述

Calponin最早發現于雞砂囊平滑肌組織中，參與平滑肌的收縮調節[1]。在早期對蛋白結合作用的研究中發現，calponin能與肌動蛋白(actin)[2]、交聯蛋白(cross-links actin)[3]、鈣調蛋白(calmodulin)[4]、原肌球蛋白(tropomyosin)[5]、肌球蛋白(myosin)[6]、結蛋白(desmin)[7]、微管蛋白(tubulin)[8]、鈣調素結合蛋白(caldesmon)[9]、凝溶膠蛋白(gelsolin)[10]結合，參與細胞增殖、細胞骨架維持等多種功能調節。

目前在脊椎動物中，已分離出calponin的三種異構體。根據其等電點(isoelectric point，pI)的不同，分為堿性調寧蛋白(h1-calponin，pI=9.4)、中性調寧蛋白(h2-calponin，pI=7.5)、酸性調寧蛋白(h3-calponin，pI=5.2)[11]。通過在多種物種中對這三種calponin異構體cDNA測序發現，h2-calponin和h3-calponin的前273個氨基酸殘基與h1-calponin高度相似，但其羧基末端序列有較大的差異，從而導致三種異構體不同的分子量大小和電荷[12-13]。這三種異構體是其三種同源基因的產物。在人類基因組里，編碼h1-calponin的CNN1基因位于染色體19p13.2-p13.1[14]，編碼h2-calponin的CNN2基因位于19p13.3[15]，編碼h3-calponin的CNN3基因位于1p22-p21[16]。這三種基因亞型表現出不同的組織及細胞特性。H1-calponin主要表達于終末分化和非增殖性的平滑肌細胞中，參與平滑肌的收縮調控[17]。H2-calponin在組織中則有更為廣泛的分布，包括平滑肌細胞、表皮角質細胞[18]、成纖維細胞[19]、肺泡細胞、內皮細胞[20]、髓系白細胞[21]。H3-calponin在平滑肌細胞及非肌細胞中均有發現，被認為在神經元重塑中參與肌動蛋白的調節[22]。

2 酸性調寧蛋白的分子生物學特點

H3-calponin最初發現于大鼠主動脈血管平滑肌中，該蛋白前273個氨基酸殘基與h1-calponin具有高度同源性，但在羧基末端的剩余57個殘基組成了一個特殊的強酸性質的結構域，與纖維狀肌動蛋白(filamentous actin，F-actin)結合，受鈣離子和鈣調蛋白的調節[23]。體外實驗研究發現，h3-calponin和h1-calponin與F-actin競爭性結合。H3-calponin與F-actin之間親和力較高，兩者的解離常數Kd值為：1.6 × 105(mol/L)-1，具有濃度依賴性，當h3-calponin與肌動蛋白分子摩爾比值為1∶1～1∶2時，兩種蛋白的結合趨于飽和。與h1-calponin能與多種蛋白結合的特性不同，雖然h3-calponin與F-actin有結合位點，但與結蛋白、原肌球蛋白、鈣調蛋白、S100(一種鈣結合蛋白)、磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)囊泡沒有較高親和力，且h3-calponin對肌動球蛋白Mg2+-ATP酶的活性抑制沒有明顯作用，這提示h3-calponin與h1-calponin的生化功能有差異。為探究其耐熱性，將h3-calponin加熱至95℃后置于0℃冰浴中3 min，再在70 000 r/min轉速下離心10 min后，80%的蛋白聚集成顆粒狀變性失活，表明h3-calponin不具有熱穩定性[24]。H3-calponin獨特的分子生物學特點決定了其獨有的生物學作用。

3 酸性調寧蛋白的生物學作用

自上世紀80年代calponin被發現以來，對其研究涉及各類細胞組織，但h3-calponin作為調寧蛋白家族中的一員，迄今是研究最少的。隨著對h3-calponin研究的深入，對該蛋白生物學作用有更進一步認識。

3.1 酸性調寧蛋白參與樹突棘重塑

H3-calponin在多種細胞組織中均有分布，但主要分布于腦組織中。Trabelsiterzidis等[25]通過免疫印跡和免疫熒光定位分別在豬、大鼠腦組織和大鼠小腦組織中分別發現分子量約為36 × 103～ 37 × 103和35 × 103～ 36 × 103的調寧蛋白樣蛋白表達，使用等電聚焦的方法，證實與Applegate等[23]報道的蛋白一致，表明h3-calponin在腦組織中也有表達。H3-calponin集中于神經元軸突的生長錐、成熟小腦及皮質細胞的膜下區域，并且在體內神經膠質細胞，如放射狀膠質細胞，膠質界膜，Bergmann膠質細胞，成熟的星形膠質細胞中也富集[26]。在海馬超微結構研究中發現，h3-calponin存在于對稱性(抑制性GABA能受體)突觸的突觸后膜，并聚集于非對稱性(興奮性谷氨酸能受體)突觸的突觸后致密物(post-synaptic density，PSD)中。此外，h3-calponin沿著樹突棘的微管分布，并與之連接，而這些微管參與樹突棘形狀和大小的改變，提示h3-calponin可能在樹突棘重塑過程中發揮作用[27]。

在氯化鋰-匹羅卡品致癇大鼠模型中，谷氨酸能神經網絡發生重組，表現為顆粒細胞軸突的異常出芽，新生突觸形成，樹突棘重塑。Ferhat等[28]在此模型中發現，當大鼠呈癲癇持續狀態時，海馬齒狀回顆粒細胞的樹突大量減少，3 d后其樹突棘開始再生，并在15 d后達到穩定。樹突棘的再生可能是由原有顆粒細胞中新的樹突棘形成和/或癲癇誘導下新生顆粒細胞樹突棘發育而成。該團隊發現h3-calponin的表達水平是在樹突棘密度增加的時期上升，猜測h3-calponin參與新的樹突棘形成。而在癲癇急性期，h3-calponin的表達水平在樹突棘內有迅速的升高，并且其升高發生在樹突棘形態及齒狀顆粒細胞密度的重塑過程中，表明h3-calponin參與樹突棘的重塑。在隨后研究中，Rami等[22]發現在體外培養的海馬神經元中，h3-calponin不僅存在于樹突棘中，也存在于樹突軸中，并且過表達的h3-calponin通過調整肌動蛋白細胞骨架的重組和動力學改變，來調節樹突棘的形態學以及密度，使樹突棘棘突延長，樹突棘密度增加。

物理因素刺激下，h3-calponin的表達水平也會發生變化。在聲波振動(40 Hz)的干預下，過表達的h3-calponin，通過調節離子型谷氨酸受體，使鈣離子濃度上升，最終誘導樹突棘的重塑發生[29]。

3.2 酸性調寧蛋白參與細胞骨架重組

H3-calponin通過調節肌動蛋白細胞骨架重組，影響細胞增殖、粘附、遷移、分化、吞噬和融合。Calponin中的CLR(calponin-like repeat)三拷貝串聯重復序列構成了兩個獨立的肌動蛋白結合位點(actin-binding site，ABS)。其中，ABS1能在體外與F-actin結合，ABS2能與不含雙CH結構域形成的F-actin結合域(F-actin-binding domain，ABD)的蛋白質相結合。Calponin能與肌動蛋白細胞骨架相結合基于ABS1、ABS2和羧基末端序列的特性。H3-calponin主要與F-actin相互作用抑制肌動蛋白在肌球蛋白上滑動，從而調節細胞骨架重組。Shibukawa等[30]發現在滋養層細胞融合過程中，h3-calponin羧基末端的S293/296位點發生磷酸化，觸發h3-calponin羧基末端的磷酸化，高度磷酸化的h3-calponin促進肌動球蛋白的收縮，促使細胞骨架重組。此外，h3-calponin作為μ-鈣蛋白酶(μ-calpain)水解產物，能被μ-calpain水解，提示h3-calponin參與由μ-calpain調節的肌動蛋白細胞骨架的重組過程[31]。

3.3 酸性調寧蛋白參與平滑肌細胞收縮調控

在平滑肌細胞中，肌動蛋白纖維組成的微絲參與肌肉的收縮[32]。Daimon等[33]在皮膚傷口愈合過程中發現，成纖維細胞增殖分化為肌成纖維細胞，h3-calponin在此類細胞增殖期表達，并參與α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)形成應力纖維。該團隊同時利用慢病毒轉染，使成纖維細胞細胞中CNN3基因下調，結果發現CNN3基因缺陷的成纖維細胞不能形成強有力的應力纖維，從反面驗證h3-calponin在肌動蛋白纖維的形成過程中發揮作用。

3.4 酸性調寧蛋白參與骨骼肌發育調節

H3-calponin在骨骼肌發育中起重要作用。Liang等[34]基于對豬骨骼肌中microRNA和mRNA配對分析發現，CNN3基因受miR-1的調控。進一步通過實時定量PCR(real-time PCR)證實在骨骼肌發育過程中，h3-calponin在mRNA上的表達水平與miR-1呈顯著的負相關。這些結果表明，h3-calponin參與骨骼肌發育調節，并且CNN3是與生長發育相關聯的基因。

3.5 酸性調寧蛋白參與胎盤形成與胚胎發育

細胞融合對胎盤發育和成熟至關重要。蛋白組學研究顯示h3-calponin在人和小鼠胎盤組織中均有表達，并調節胎盤中滋養層細胞融合。在下調CNN3基因表達后，反而促發肌動蛋白細胞骨架重組和合胞體的形成，提示h3-calponin在滋養層細胞融合過程中起負性調節的作用[30]。在人類胎盤形成過程中，胎兒的滋養層細胞分化為侵襲型和非侵襲型，h3-calponin在低氧條件下，通過激活p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)和細胞外信號調節激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)誘導滋養層細胞發生侵襲[35]。Flemming等[36]通過運用基因靶向技術分別敲除小鼠CNN1、CNN2、CNN3基因，發現敲除了CNN3基因的小鼠由于中樞神經系統發育缺陷在胚胎期和新生期即出現很高的死亡率，表明h3-calponin在胚胎形成期起關鍵性作用。

3.6 酸性調寧蛋白參與細胞信號轉導

細胞信號轉導是指，通過細胞膜或細胞內的受體在細胞通過時感受到信息分子的刺激，由細胞內信號轉導系統轉換，從而影響細胞生物學功能的過程。在成纖維細胞遷移過程中，h3-calponin通過調節細胞外信號調節激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)介導的l-鈣調素結合蛋白的磷酸化，參與其遷移過程[37-38]。MEKK1是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路中的重要成員，MEKK1介導的h3-calponin發生磷酸化，增加細胞外基質的粘附性及細胞表明張力，增強細胞的收縮力[39]。

4 酸性調寧蛋白的臨床應用

H3-calponin的表達變化與多種疾病的發生進展相關，可輔助臨床上多種疾病的診斷及其預后的判斷。Han等[40]通過基因芯片掃描發現，耐藥性癲癇患者腦內的CNN3基因的表達明顯上調。對耐藥性癲癇患者腦組織以及顳葉癲癇大鼠腦組織中的h3-calponin進行檢測，其表達水平較正常組有明顯的升高，提示h3-calponin在腦內的表達與癲癇活動程度密切相關。該團隊同時對不同發作程度癲癇患者腦脊液中h3-calponin進行檢測發現，反復癲癇發作患者的腦脊液中，h3-calponin的表達水平明顯升高，提示腦脊液中的h3-calponin水平能夠作為一種潛在的與癲癇發作相關的生物標記物，并利于癲癇和耐藥性癲癇的鑒別診斷。Nakarai等[41]在大腸癌患者術后組織標本中檢測到h3-calponin的表達上調顯著，并且更具有特異性和穩定性，認為h3-calponin的表達水平可作為大腸癌淋巴結轉移的檢測指標，可作為大腸癌淋巴結早期轉移的診斷標志。在對CNN3基因與疾病關系的檢測中發現，黏膜相關淋巴組織淋巴瘤中CNN3基因發生重排[42]，而在卵巢癌中，CNN3的表達與該疾病進程相關[43]。雖然需要進一步的研究以明確CNN3的有效性，但以CNN3為診斷或治療靶點的臨床方法具有很大實施潛力。

5 小結及展望

自calponin發現以來已有三十余年，作為肌動蛋白相關調節蛋白，它在參與平滑肌收縮和非肌細胞活動方面被研究的頗為廣泛。H3-calponin雖是calponin家族最“年輕”的成員，但隨著對h3-calponin的進一步認識發現，它不僅僅在調控神經元可塑性中起主要作用。對這三種基因的起源研究顯示CNN3相對于另外兩種基因更古老，提示h3-calponin可能更能代表calponin蛋白的本質，值得未來更深入的研究。