哺乳動物雙極細胞生理構造及功能比較研究進展

張 馳，胡 敏*，孫曉梅，周 圓

(1.昆明醫科大學第四附屬醫院眼科，云南省眼科研究所/云南省眼科疾病防治研究重點實驗室， 昆明 650021； 2.北京協和醫學院/中國醫學科學院醫學生物學研究所，昆明 650118)

視網膜雙極細胞是哺乳動物視覺系統的第一個“投射神經元”，它收集由感光細胞轉化生成的電信號，通過不同類型雙極細胞(bipolar cells)的收集和整合，繼續傳遞至無長突細胞和神經節細胞(retinal ganglion cells，RGCs)，以便在視網膜內進一步處理。這一過程中，無論昆蟲或是人類，所有視覺形成所需的信息都是通過這種視網膜內連接方式來傳遞。在當前研究下，生物物理學、藥理學、膜電容測定、熒光生物傳感器和雙光子顯微鏡等技術的不斷完善，特別是相關的免疫組化技術發展更為迅速，通過這些方法逐漸發現至少有10余種不同類型的雙極細胞以不同方式系統地轉換光感受器輸入信號，從而激發編碼感光刺激特性的特定通道[1]。由于雙極細胞對視覺研究的重要性日益增加，及其在感覺神經元中的代表性意義，對視網膜雙極細胞的研究成為熱點。本文綜述近十年運用免疫組化等方法利用大、小鼠及非人靈長類等實驗動物而展開的雙極細胞生理構造及功能的比較研究進展，目的是通過動物實驗獲得視網膜雙極細胞形態、功能和突觸可塑性等相關數據，更好的為人類臨床眼底疾病治療探尋新的思路和方法。

1 雙極細胞的歷史發展

視覺系統的一個突出特征是在視網膜中存在異常大量的神經元“硬件”，與其他主要的感覺系統相比，視覺系統中存在一層特殊的神經元，隨機分布于其所在的空間之中[2]，將初級感覺神經元與長投射神經元連接起來，即視網膜雙極細胞層。Tartuferi[3]被認為最早發現并創造了“雙極細胞”這個術語，即：哺乳動物中具有兩個突起的視網膜中間神經元，因其“一個向上”和“一個向下”的細胞形態而創造出“雙極細胞”一詞。這種獨特的形態是其功能的一個標志，因為雙極細胞的主要功能即連接外層和內層視網膜。人們也一直通過實驗動物與人類視網膜相似的地方來研究雙極細胞在視網膜中信號整合等方面的作用[4]，從而進一步提高眼科疾病患者復明的希望。

2 雙極細胞的多樣性

在哺乳動物視網膜中存在十多種雙極細胞類型，根據對光反應極性的不同，包括：給光型視錐雙極細胞(ON-cone bipolar cell，ON-CBC)和撤光型視錐雙極細胞(OFF-cone bipolar cell，OFF-CBC)，前者略多于后者，同時，還包含一種給光型的視桿雙極細胞(rod bipolar cell，RBC)[5-6]，然而，這在非哺乳類動物中可能有很大差異。例如：在斑馬魚中大概含有20多種類型的雙極細胞，其中包括幾種雙層甚至三層的類型，這可能由于它們的光感受器多樣性較高所致[7]。現已證實小鼠體內一共存在有15種類型的雙極細胞[8]，包括：一種RBC；1 ～ 9型CBC，其中3型分為3a和3b兩種，5型分為5i、5o和5t三種；一種新型X雙極細胞和近期新發現的一種沒有樹突的特殊類型的雙極細胞[9-12]。在其他被研究的哺乳動物中，如：貓、兔、大鼠、小鼠、地松鼠、獼猴等，其雙極細胞的類型數目也穩定在大約10余種左右[13]。

3 雙極細胞類型的鑒定及比較

哺乳動物視網膜雙極細胞類型的解剖或組織學鑒定，對于應用其遺傳學分析視網膜回路和分析引起視網膜疾病的基因具有重要意義。通常比較不同哺乳動物雙極細胞分類的主要標準是依據細胞的免疫組織化學特征，樹突狀分支模式以及在內叢狀層(inner plexiform layer，IPL)突觸終端的形狀和分層程度。其中，軸突形狀和其在IPL分層水平通常是雙極細胞類型識別的最佳依據；此外，樹突形態的差異，如接觸的光感受器的數量和類型，也有助于區分雙極細胞類型。然而，不同物種的視網膜在各自生活環境中發生了不同的適應，如樹鼩等晝行性動物具有更多的視錐細胞[14]，貓等夜行性動物多含有豐富的視桿細胞[15]。許多哺乳動物表現出獨有的視網膜特征，如非人靈長類動物的視網膜中心凹[16]，在兔眼中存在的視覺條紋和不同視錐蛋白的分泌[17]，小鼠不同的RGCs在視網膜的分布[18-19]。此外，由于歷史原因，雙極細胞類型命名在不同物種之間仍然不一致。這些都導致很難僅僅根據細胞形態來進行物種間的比較。

一般認為哺乳動物IPL被細分為五層，厚度幾乎相等。在小鼠中，這些層可以通過免疫細胞化學標記鈣視網膜蛋白(calretinin)來確定，它是揭示這些特征的重要工具。然而，在同種雙極細胞中，細胞標記的表達似乎在不同物種之間有很大差異。許多標記似乎又可以在不同的物種中標記同源雙極細胞類型。研究發現，針對蛋白激酶Cα(protein kinase Cα，PKCα)的抗體最早發現可標記魚視網膜雙極細胞[20]。后來逐漸發現可應用在鼠、兔、樹鼩、獼猴等大部分哺乳動物視桿雙極細胞的標記[1, 21]。鈣結合蛋白calbindin在非人靈長類視網膜上可標記所有視錐細胞、一種OFF-CBC和一種水平細胞[22]；在兔視網膜中，calbindin強表達于一種ON-CBC和一種水平細胞；而在大鼠和小鼠視網膜中，calbindin則可見于水平細胞、無長突細胞和RGCs，在雙極細胞中則看不到[23]。除了上述標記物外，如：鉀/鈉超極化激活環核苷酸門控通道4(hyperpolarization activated cyclic nucleotide-gated potassium channel 4，HCN4)的表達，標記了跨物種間明顯的非同源細胞類型。在某些情況下，可以通過選擇免疫組化的方式來區分單群種的雙極細胞，例如，小鼠的3a和3b型雙極細胞[24]，它們在形態上非常相似，可采用表達HCN4和蛋白激酶調節亞基IIβ(PKA的一個調節亞單位，protein kinase regulatory subunit II beta，PKARIIβ)的方式，通過觀察其樹突與軸突在視網膜的形態，來區分兩種類型的細胞[6]。這是許多視網膜神經元類型區分的基本規則。

過去的研究中，在這方面已經取得了一定進展，但到目前為止，還沒有清晰描述出所有雙極細胞的免疫組化表達標記，小鼠和地松鼠是為數不多的研究較為完善的兩類實驗物種。

在以視桿細胞為主的小鼠視網膜中：所有的ON-CBC可以表達G蛋白亞基Gαo和Gγ13[25-26]，RBC可以特異性表達PKCα及鈣結合蛋白5(calcium binding protein 5，CaB5)[27]，同時CaB5還可以表達在3a/b、5、6型雙極細胞；從神經激肽3型受體(neurokinin 3 receptor，NK3R)的表達可以鑒別出1型和2型OFF-CBC，但是它們之間更為細致的差別無法區分[27-28]；HCN4可顯示3a型雙極細胞，PKARIIβ可顯示3b型雙極細胞[29]，恢復素(recoverin)可表達于2型雙極細胞[30]，calsenilin蛋白可表達于4型雙極細胞[31]，促泌素(secretagogin，SCGN)表達較為廣泛，可顯示于2、3a/b、4、5、6型帶有明顯樹突標志的雙極細胞[32]。

在以視錐細胞為主的地松鼠視網膜中：通過免疫組化區分了8種不同的視錐雙極細胞類型(3種ON型和5種OFF型)和一種RBC。與小鼠相類似，Gγ13可標記ON型雙極細胞，recoverin、HCN4可標記OFF型雙極細胞，CaB5可表達兩種ON-CBC及兩種OFF-CBC，細胞粘附分子分化抗原15(cluster of differentiation 15，CD15)廣泛分布于ON-CBC。與大多數哺乳類不同，PKCα并非只標記RBC，其在幾種不同的雙極細胞類型均有出現[26, 33]。其他可靠的雙極細胞免疫細胞化學標記物依然有待探索。

4 雙極細胞與其上下級神經元之間突觸的結構特點

視網膜是由三個細胞核層以及兩個叢狀(突觸)層構成[34]。光線進入眼睛后，通過整個組織首先到達視網膜的外部光覺感受器——視錐細胞和視桿細胞。視錐細胞軸突末端膨大，在多個雙極細胞的樹突形成突觸。然而視桿細胞的終足形成球狀，只與單個雙極細胞的樹突形成突觸，單個雙極細胞突觸終端的光信號活動可以在鈣離子[35-36]或谷氨酸[37-38]信號水平上隨著其在突觸的釋放被常規記錄下來，從而繼續向下一級神經元傳遞。在外叢狀層(outer plexiform layer，OPL)上形成第一突觸層，該層信號分布在10余種雙極細胞上，形成平行的信息通路，為內層視網膜提供高度預處理的興奮性信號[9, 39-40]。在IPL、OFF-CBC的樹突前膜沒有緞帶突觸，其突觸后膜表達離子型谷氨酸受體(ionotropic glutamate receptors，iGluRs)。而ON-CBC和RBC樹突會與視網膜水平細胞的樹突陷入突觸前膜形成陷入型突觸，并與光感受器形成的緞帶突觸[41]，其通過代謝型谷氨酸受體6亞型(metabotropic glutamate receptors 6，mGluR6)、多巴胺受體等的活動可受水平細胞調控[42]。在這里，光感受器還可以和水平細胞的神經元相連接，當水平細胞接受光感受器的突觸傳遞后與光感受器和雙極細胞的突觸終末端形成突觸聯系，然后通過三者間縫隙連接將沖動傳遞給RGCs，這種反饋性突觸的形式在視網膜信息傳遞中也是極為重要的[43-44]。

隨后，雙極細胞軸突末端與無長突細胞和RGCs的突觸連接[45]。無長突細胞是視網膜細胞中最為多元的細胞類型(存在42種左右的類別)，主要向雙極細胞和RGCs提供神經調節性的信號[1, 46]。20余種RGCs整合來自雙極細胞和無長突細胞的信號，并將結果編碼為一系列的信號源，通過軸突被傳送到更為高級的視覺中心，最終將視網膜的信號提供給大腦，從而完成整個光信號在視神經系統中傳遞的任務[6, 47-48]。來自小鼠視網膜的聯接組學數據[9]和轉基因動物的大量數據表明雙極細胞可以表達特定的受體蛋白，同時不同物種的免疫標記[49-51]反映出雙極細胞軸突末端與無長突細胞和RGCs樹突的共分層，這是突觸連接性的有力標志。

5 雙極細胞的生理與電生理調控

研究表明，哺乳動物的RBCs以外向型鉀離子電流為主要特征，其在視功能活動中占有主要的地位。在針對小鼠、非人靈長類動物和人類的視網膜RBCs進行全細胞膜片鉗電生理技術記錄時發現：當給予去極化及超極化脈沖刺激時，均表現出去極化脈沖時的外向鉀離子電流[52-53]，然而在不同亞型的RBCs之間這種外向型電流是有差異的。其中有不到5% RBCs會發出微弱的內向鈉離子電流，Ohkuma等人[53]認為這種鈉離子電流在雙極細胞層面的視覺電生理活動中作用甚微。Walston等人[54]發現，ON型雙極細胞對電刺激具有去極化電壓瞬變的反應，這與電刺激的幅度、脈沖寬度和頻率有關，而對于OFF型雙極細胞通路尚未有更多的探索。對OFF型雙極細胞通路的特性的研究對于研究人員了解視網膜具有重要意義，需要進一步探究。

視網膜電圖(electroretinogram，ERG)是眼科臨床視覺電生理重要的輔助檢查之一，可進行視覺功能預測，眼部疾病受累部位判定等。一般認為在ERG中：a波主要來源于感光細胞的感受器電位；b波幅度較大，主要與雙極細胞的活動有關；c波上升緩慢而持久，可能與色素上皮細胞層的正常功能有關；d波為一種撤光反應。而在哺乳動物的相關實驗中發現：豚鼠較獼猴ERG各指標數據明顯降低；大鼠與獼猴相比，其數值也相對偏離；從總體數值上可以發現，獼猴視網膜電圖各指標較其他動物更接近于人類[55]。

6 雙極細胞突觸可塑性

正常情況下，成年哺乳動物視網膜是一個穩定的神經網絡系統，但當其因損傷或疾病而造成光感受器的丟失時，它可表現出結構和突觸的可塑性。由此表明內層視網膜神經元的傳入影響著視網膜組織結構，導致視覺回路連接和功能的異常[34]。Dunn等[56]通過對三種類型的雙極細胞突觸及其共同的光感受器靶點的成像研究，發現發育中不同類型的小鼠視錐雙極細胞參與不同的樹突生長過程，有針對性及探索性的與光感受器建立連接，并粘附在不同的突觸區域。同時，每種突觸類型都在同一時間尺度上建立同一傳入方式的最終連接模式。這種不同的策略和時間安排的模式，可以促進多個突觸后細胞類型的共同傳輸，從而產生不同功能的平行電路。研究還表明，在發育過程中光感受器和雙極細胞之間突觸正確連接的分子機制在視錐通路和視桿通路之間存在差異[57]。Beier等[58]發現，成年哺乳動物視網膜光感受器損傷后，健康的光感受器及其周圍的突觸終末端會橫向移向損傷區。雙極細胞可以重新建立與視桿細胞和視錐細胞的連接，恢復視網膜明適應和暗適應的視覺敏感度。同時，視桿雙極細胞延長樹突，與損傷周圍正常的視桿光覺感受器形成新的突觸。而視錐雙極細胞并沒有表現出明顯的樹突狀重組，其原因可能與視桿細胞的特殊結構和其代謝功能的敏感性有關[59]。這些發現表明不同的雙極細胞類型，代表不同的視覺通路，它們對光感受器喪失的反應和由此產生的樹突狀結構改變不同。但支持了雙極細胞重新與受損光感受器建立新的突觸的觀點，從而提高了視網膜變性導致失明患者視力恢復的可能。

7 展望

將小鼠、非人靈長類等實驗動物作為對人類臨床治療探究的修正手段意義重大。隨著對哺乳動物視網膜的深入研究，綜合運用免疫組化、生物物理學、藥理學、膜電容測定、熒光生物傳感器和雙光子顯微鏡等技術，視網膜雙極細胞特征研究進展十分迅速，其中免疫組化技術更為突出，這使得人們對視覺通路的一般組織原理有了更新、更深的認識，從而將其“面紗”逐漸層層揭開。雙極細胞遠不是簡單地將感光信號傳遞到視網膜內部的等電位神經元，而是實現視覺系統處理鏈中的一個關鍵環節。同時，隨著對雙極細胞突觸重塑的探尋發現，也鼓勵了通過對雙極細胞重新引入和改造來使視網膜疾病患者恢復視力的想法。然而，在成人視網膜中，識別相關突觸生長發育的分子機制還需要進一步漫長的研究。