基于復合因素誘導功能性消化不良大鼠模型的研究評述

龍 濤，郭保君，趙 映，張璞玥，鄭華斌，陳 媛*

(1.成都中醫藥大學針灸推拿學院，成都 610075； 2.成都中醫藥大學附屬醫院，成都 610072)

功能性消化不良(functional dyspepsia，FD)是一種無明確器質性病因的胃腸道功能性疾病[1]。胃動力異常和內臟高敏感性是FD發病機制中最重要的環節[2]，FD動物模型也主要基于這兩個因素進行模擬。目前國內外分別以成年大鼠郭氏夾尾應激法[3]和乳鼠碘乙酰胺灌胃法[4]為主。也有文獻采用嗎啡、阿托品等化學藥物及電極刺激法、酸刺激法、慢性束縛應激法[5-11]等造模，但因臨床差異較大或不具代表性而應用較少。鑒于單因素誘導FD的局限性，以及復合因素誘導模型更加符合疾病的發病特點和病理特征，本文將對復合因素誘導FD大鼠模型的造模方法進行分析，為FD大鼠造模提供更好的思路與方法。

1 FD大鼠模型的誘導

1.1 雙因素誘導造模法

1.1.1 碘乙酰胺灌胃結合夾尾刺激法

吳震宇、李曉玲等[12-13]采用了碘乙酰胺灌胃結合夾尾應激法誘導FD大鼠模型。將每只10日齡SD幼鼠予以0.1%的碘乙酰胺與蔗糖混合液0.2 mL/d灌胃，持續6 d；灌胃結束后，大鼠正常飼養至7周齡；再對大鼠行夾尾刺激1周后，造模結束。相較于任一單因素造模，該方法同時模擬了不同的FD發病病因，即胃部炎癥與情緒的雙重干預，模型成因更加符合臨床。吳震宇等[12]還從大鼠體重變化、胃組織病理觀察、3 h攝食量及胃排空率等方面對模型予以驗證評價，結果發現該方法誘導的模型從內臟高敏感、胃順應性降低、胃排空延緩三大FD病理機制方面，都較好地模擬了FD特點，且其穩定性、可重復性和可操作性較好，不失為一種有效簡單、值得推廣的造模方法。

1.1.2 碘乙酰胺灌胃結合其他刺激法

有多位學者[14-15]采用碘乙酰胺灌胃結合小平臺站立法進行FD大鼠造模。7日齡幼鼠予碘乙酰胺灌胃6 d后，正常喂養至6周齡時，加用2周改良的小平臺法[16]，對大鼠造成機體應激的同時，使其因過度勞倦而產生焦慮抑郁的情緒應激。劉成全等[17]對6日齡SD幼鼠造模后從一般狀態、體重、攝食量、相關胃腸激素及尿D-木糖排泄率等方面出發，橫向對比了碘乙酰胺灌胃配合小平臺站立法、單純碘乙酰胺灌胃法，碘乙酰胺灌胃配合游泳法三種方法，結果發現三種方法均可模擬FD癥狀，但碘乙酰胺配合小平臺站立法的FD癥狀出現最早，且從體重、攝食量變化及相關胃腸激素水平來看，成模效果最佳，明顯優于其他兩種方法。

1.1.3 夾尾結合其他刺激法

夾尾應激造模，是國內應用最普遍的單因素造模方法。為獲得更佳的造模效果，多位學者在其基礎上配合了其他方法進行復合造模。如王煜姣等[18]改良了夾尾應激法，對200 ～ 220 g Wistar大鼠每天夾尾2次，每次30 min，連續刺激4周；不僅減小刺激強度，使其更符合FD特點，還疊加不規則喂養法，并設置單因素陽性對照組進行優劣比較。通過對大鼠一般狀態、行為學測試、胃和小腸排空率的對比，顯示復合方法的模型更符合FD病理機制特點，成模效果優于單純夾尾應激。也有實驗使用夾尾法結合大黃灌胃法[19]或結合不規則喂養法[20-21]來建立FD模型，但實驗中未對比單因素與復合因素優劣，故對于復合因素造模是否有優勢其實并未作出科學評價。

1.1.4 稀酸灌胃結合其他刺激法

有研究表明稀酸可以抑制胃蠕動，延緩胃內壓的恢復和胃排空[22]，誘發相關FD癥狀，因此部分學者[23-25]將稀酸灌胃與不規則飲食法相結合來建模。如馬建麗等[24]對模型組145 ～ 175 g Wistar大鼠予不規則喂養方法處理，單日進食，雙日禁食，飼養4周，同時自由飲水(每升水加10 mol/L鹽酸10 mL)。盡管從胃電節律和胃腸組織病理結果顯示該種方法誘導的大鼠符合FD特點[25]，然而目前稀酸刺激的復合造模法應用很少，相關的評價方法并不全面，因此更好地完善該復合方法的模型評價和對比實驗是非常必要的。

1.2 多因素誘導造模法

近年來，有多位學者采用多種刺激因素進行聯合誘導FD造模，試圖獲得成模效果更佳的FD模型。如D’Aquila等[26]交替使用多種刺激因素對大鼠進行誘導造模：(1)禁食24 h，(2)束縛30 min，(3)超聲刺激2 h，(4)夾尾1 h，(5)明暗顛倒24 h，以上方法每天隨機選取一種，相鄰2 d只能使用不同刺激方法，造模時間共3周。郁保生等[27]利用3月齡SD大鼠，以及姜蘇南等[28]利用3月齡Wistar大鼠，在慢性束縛應激配合飲食失節的基礎上，分別結合過度疲勞法、夾尾激怒法，建立中醫肝郁脾虛證FD大鼠模型。此外，還有學者是對3月齡SD大鼠采用慢性束縛應激、過度疲勞、飲食失節結合夾尾、搖晃進行多種因素共同干預[29]。可以看出，現有多因素結合建立的模型基本上都采用到了束縛激怒和飲食失節的方法使大鼠處于焦慮抑郁和饑飽無常的狀態，達到同時對動物機體和心理雙方面進行模擬的目的，盡可能的使其接近現代人類FD發病的狀態，而其中情緒干預是不容忽視的重要手段之一。

盡管多因素造模更多是為了累積不同刺激效果獲得更接近人體FD的模型，但并非干預手段累積越多成模效果就越好。以上多因素造模研究基本都存在模型評價方法單一甚至沒有評價方法的問題，因此需進一步完善其評價手段。模擬過程中疊加因素越多，給模型評價帶來的干擾就越大。研究基本認為多因素造模更有優勢，但在目前沒有FD造模方法統一標準的情況下并未與其他單因素等方法進行對比和評價，既不能證明多因素較單因素造模更具優勢，也無法評估成模是由多種刺激中某種刺激因素發揮了主要作用，還是聯合刺激發揮的協同作用，這給未來病理機制的深入研究和高質量模型的建立帶來諸多困難。此外，刺激因素越多，操作步驟也越復雜，操作上的容錯率更低，失誤的累積也會導致實驗結果與真實值偏差更大，時間和成本花費也就相對越多。

因此造模同樣需要綜合考慮成本、周期以及重要的模型穩定性等因素并進行合理化的選擇。而無論是單因素、雙因素或者多因素造模，選擇施加的刺激因素，與模型的穩定性和有效性息息相關。因此，在造模的實施中應盡量選擇明顯符合FD癥狀，且停止刺激后癥狀能維持較長時間，不會輕易耐受或自愈的干預方法進行造模，從而提高模型的穩定性。

2 FD大鼠模型的評價

無論是夾尾刺激還是小平臺站立，都是以大鼠暴怒或勞倦產生焦慮、抑郁等情緒障礙為基礎進行的復合因素誘導內臟高敏感性模型，而對應的評價方法多種多樣。國外文獻大多均采用胃動力測定對模型予以評價；而國內文獻大多從大鼠的一般狀態、體重和攝食量的變化進行判斷，也有少量文獻增加了行為學測試、胃排空率或胃腸激素進行評價。但筆者認為這類模型的評價，不僅需要設置對一般狀態的觀察，而且應當深入對單純行為學測試的探討。

2.1 一般情況評價

造模期間通過定期對比觀察各組大鼠的毛發色澤，攝食量和體重變化，精神狀態、情緒反應，大小便等情況，輔助評價造模效果[31]。如果除了體重變化外大鼠還出現神疲乏力，毛發變暗、不順，便軟甚至出現稀便等情況，則證明FD造模成功。通過參考人類FD癥狀，這種方法給我們提供了輔助評價動物FD的可能，但由于該方法大多需要肉眼觀察癥狀，主觀因素強，不同人員對同一情況的描述可能有不少差異，國際上也沒有統一的標準，除了攝食量和體重數據變化外，毛發等指標可信度并不高，因此在國外應用較少。

2.2 行為學測定

通過借助儀器記錄更客觀真實的數據從而對大鼠的體力、行為，以及焦慮、抑郁等精神狀態等進行深入分析評估，從心理情緒層面予以客觀評價。如Liu等[4]利用糖水偏好測試、敞箱實驗等行為學測試對大鼠焦慮、抑郁狀態進行評估。筆者以為，盡管FD與精神心理因素密切相關[32]，該方法也是評價動物精神狀態的國際標準之一，但FD發病機制復雜，若通過疼痛激怒大鼠造成情緒刺激后再測試其情緒變化，當大鼠行為學上處于焦慮抑郁狀態時即認定FD造模成功，而無其他胃腸動力方面的客觀指標佐證時，這種認定就有失客觀，因此該方法也有不足之處。

2.3 胃動力測定

胃動力測定，包括胃排空率、胃敏感性和胃順應性，基本覆蓋了FD主要的病理生理改變，是目前國際上公認的可信度高的FD評價手段。胃排空率主要分為灌胃法檢測胃排空率[29, 32]和自主喂食法檢測胃排空率[33-34]。前者一般采用灌胃后檢測標志物的殘余量，后者是待大鼠自主進食后不久檢測食物殘余量。兩者后續取胃操作和原理基本相似，但自主喂食法省去了大鼠灌胃環節，通過模擬正常進食減少外界干擾，比灌胃更接近生物真實的胃排空狀態，不僅能觀察大鼠攝食量的變化，還可避免灌胃給大鼠造成的精神刺激對實驗產生的影響，以及操作不慎可能帶來的組織損傷及意外死亡風險，因此在相同條件下，自主喂食法更具優勢。而Liu等[4]在研究中發現，在FD大鼠模型身上胃敏感性和胃順應性的差異體現最為明顯。兩種檢測方法均采用胃內植入氣囊的方式，分別測得模型動物胃擴張刺激時的頸部肌肉群肌電反應[35-38]以及計算球囊容積與壓力的比值[39-40]。兩者的器材、手術操作流程基本相似，主要差異在氣囊的形狀、體積和具體加壓步驟。需要注意的是，除了氣囊的直徑、形狀外，氣囊植入術后應予大鼠足夠的時間用于恢復創傷，否則傷口的感覺異常可能會干擾最后實驗結果，不過具體影響則有待相關實驗加以驗證。

因此筆者認為，在對FD大鼠尤其是這類夾尾或束縛、孤養等處理后存在情緒障礙的內臟高敏感模型予以模型評價時，除了一般狀態，攝食量和體重，胃組織病理變化等國內常用的方法外，研究人員也應參考國外相關文獻，選擇胃動力學測試對模型予以綜合評價，這樣對于評價方法的進一步完善以及甄選可制備高質量FD模型的復合因素更具有積極意義。當SD大鼠誘導造模期間及造模完成時，大鼠存在體重增長緩慢，胃排空率顯著降低，尤其是胃敏感性顯著增加而胃順應性也顯著降低的同時大鼠胃黏膜并未出現確切器質性病變，即完成FD模型的建立。

3 結語

縱觀目前FD大鼠模型的研究，單因素和復合因素各有利弊。單因素既有相應的適用范圍，也存在一定短板，并非唯一選擇。其造模優點在于簡單易行，重復性較好，如果涉及到對某些單一具體的病理機制研究就非常適用，因此單因素一直也是常規造模手段。然而單因素造模存在的問題是，FD的病因至今仍不是十分明確，單因素造模目前基本是從胃動力異常、內臟高敏感性或胃酸分泌增多等方面復制FD單一的病理機制，因此不能充分地體現FD于人類機體上病理狀態和癥狀表現的復雜多樣，與實際臨床有不少差距，局限性也會相對明顯。而另一方面，從實驗成本出發，復合因素造模也許并非首選，但如果從發病機制和癥狀出發，在解剖和功能、機體和心理情緒等方面進行綜合模擬，將兩種手段結合并運用于FD模型的誘導，使模型具有胃動力異常、內臟高敏感性等多維度病理機制的特點，相對更貼近臨床，模型的本質就可向人類FD的發生發展病理過程進一步靠攏，也就有望制備出更完善和穩定的FD模型。

然而關于復合因素造模是否較單因素更有優勢的問題，現有相關文獻的解答尚有缺陷。有文章對單復因素的優劣進行了對比驗證，從初步結果得到復合因素成模效果更佳的結論，但實驗中缺乏足夠客觀的依據如胃敏感性和胃順應性的差異來說明和驗證復合因素的優勢，僅僅依靠大鼠的一般情況觀察及胃排空率等仍顯不足；同時實驗普遍未提及造模過程中大鼠的存活率與死亡率，死亡是造模致死還是其他意外致死，而如果造模方法致死率較平均水平高，相對推廣難度就更大，應用價值也會降低；復合因素造模方法形式多樣，缺乏統一的標準；即使采用了相同造模方法，不同的模型評價指標，對實驗結果也會產生不小的影響。除此之外，文獻基本未描述造模后大鼠FD癥狀的持續時間及自然恢復時間，也未見有文獻將其作為模型質量高低的一個評價指標來加以論述；而不同品系的大鼠(Wistar/SD)構建的FD大鼠模型其穩定性和生理病理指標是否存在差異，這些問題都需要一個統一的造模標準和評價標準才能進一步解答。

因此，筆者認為今后仍需要在以下幾點上繼續深入研究：(1)摸索一種造模效果穩定良好的方法，形成FD大鼠模型的建立標準。研究人員應當努力探求符合自然發病狀態的方法，比如將國際上通用的碘乙酰胺灌胃法與國內傳統的SD大鼠改良夾尾法相結合進行造模。兩種方法囊括了FD最重要的兩個發病機制，而初步評價造模效果也較好，然而復合因素模型在病理生理學等指標上是否更具有代表性和優勢，未來還需要進一步實驗進行對比驗證。(2)確定適宜的統一模型評價方法。鑒于FD最主要的診斷標準是無器質性病變，因此筆者認為，首先參考國外以著重使用胃動力測定方法評價FD為主，如胃排空率尤其是胃敏感性或胃順應性的檢測。而在胃組織病理觀察檢測排除器質性病變的基礎上，配合上記錄大鼠體重增長變化、攝食量變化等手段來輔助評估模型，有助于從功能、癥狀等外在表現方面，進一步完善模型的評價。

總的來說，統一的造模實驗標準將是本研究團隊未來致力完善和突破的內容。