靈長類巨細胞病毒慢性潛伏再激活誘導免疫衰老的研究進展

王宇虹，曲光瑾，肖 沖，鄧 巍*

(1.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院干部病房，哈爾濱 150001； 2.解放軍總醫(yī)院國家老年疾病臨床醫(yī)學研究中心，北京 100039； 3.中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，北京 100021)

巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)是一種分布廣泛的古哺乳動物病毒，遺傳證據表明目前進化的CMV與宿主在哺乳動物物種具有共同的祖先[1]。人類巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)在人群中廣泛感染，其全球感染率高達60% ～ 100%[2]。在免疫活性宿主體內，HCMV保持終生持續(xù)感染的能力，無論原發(fā)性還是復發(fā)性HCMV感染通常都是亞臨床的[3]。因此，對于免疫功能正常的HCMV攜帶者，HCMV逃避宿主高水平的抗病毒免疫反應，與宿主終身穩(wěn)定共存，其免疫逃避機制一直是免疫研究的重要挑戰(zhàn)。而對于免疫功能障礙的感染者，HCMV可導致嚴重的疾病，甚至致死，這對HCMV的疫苗開發(fā)和藥物治療提出了重要的挑戰(zhàn)[4]。對于免疫衰老的HCMV攜帶者，病毒的免疫逃避機制，與免疫適應性集中體現的免疫衰老之間的相互作用，則更加微妙復雜[5]。

由于β-皰疹病毒類具有種屬特異性，導致HCMV病毒不能在任何動物模型直接研究[6]。每個物種的CMV高度適應其各自的宿主物種，這種高度種屬特異的CMV基因組特點，反映了其與宿主密切的進化關聯性。鼠類由于不具有CD28丟失性，無法針對其進行CMV感染后免疫衰老機制的研究[7]，因此首選非人靈長類動物進行CMV慢性潛伏再激活誘導免疫衰老的動物模型構建。HCMV最接近的種屬是黑猩猩，由于價格、飼養(yǎng)和倫理等問題，并不是一個具有良好可行性的CMV動物模型，所以獼猴CMV(rhesus cytomegalovirus，RhCMV)感染模型是目前研究HCMV感染的最優(yōu)選非人靈長類動物模型。從宿主角度，感染RhCMV的圈養(yǎng)和野生猴子無處不在；而且RhCMV的感染宿主內也存在和人類一樣的慢性潛伏再激活的反復免疫誘導機制[8]。從病毒角度，RhCMV和HCMV基因組的大小、結構和基因組織相似。RhCMV的基因組突變與HCMV基因組的突變具有共線性，近60%潛在致病蛋白與HCMV蛋白具有同源性，這些同源蛋白主要集中在病毒的結構和免疫調節(jié)蛋白，G蛋白偶聯受體和蛋白參與核酸代謝、DNA復制和轉錄調控蛋白[9]。故本文從宿主三個免疫狀況角度，分別闡述人類巨細胞病毒HCMV和獼猴巨細胞病毒RhCMV的感染免疫研究現狀。

1 免疫活性正常的HCMV感染和RhCMV感染的免疫狀況

HCMV在大多數健康人的早年原發(fā)感染，隨即啟動終身潛伏感染。在潛伏期間，病毒發(fā)生頻繁的再激活，反復感染，病毒反復的復制表達，誘導人免疫系統產出HCMV特異性抗病毒免疫清除和炎性反應，使病毒始終處于亞臨床狀況[3]。宿主的免疫系統能有效的控制病毒傳播，但是與絕大多數抗病毒免疫反應可以有效保護宿主免受病毒入侵和再次感染不同，HCMV仍可廣泛原發(fā)感染、持續(xù)終生并且定期繼發(fā)機會性感染。其自身的免疫適應性和選擇性壓力使其自身擁有數百萬年的免疫逃避優(yōu)勢；另一方面，宿主始終無法清除潛伏在骨髓干細胞的病毒儲存池，由此產生了不同病毒株的超級感染[10]。RhCMV廣泛存在于種群中，在性成熟的年齡(2.5 ～ 3歲)，血清陽性率達到100%左右，這導致原發(fā)性RhCMV研究的成本激增。通過對隔離的幼年恒河猴進行原發(fā)感染，證實RhCMV的感染形式與人類很接近。RhCMV在首次感染后建立了終生潛伏感染，病毒的宿主內播散發(fā)生在唾液、淚液、尿液、排泄物、精液、母乳和宮腔中[11]。自然暴露實驗接種RhCMV感染的健康免疫獼猴臨床癥狀輕微，病理、組化和尸檢顯示RhCMV在多種組織和器官內多種細胞內有宿主內播散，且與HCMV-DNA陽性細胞分布高度相近[12]。

CMV的免疫逃避機制是CMV持續(xù)終生感染的重要機制，包括非常復雜的分子調控網絡。由HCMV編碼的眾多具有免疫調節(jié)功能的蛋白，可以干擾宿主細胞的信號轉導，活化細胞內和跨細胞運輸以及細胞的凋亡[13]。大多數編碼RhCMV免疫調節(jié)蛋白與HCMV的同源性低，但體外研究顯示出相似的功能，HCMV細胞凋亡抑制機制也存在于RhCMV。RhCMV中的UL36(caspase-8介導凋亡，病毒抑制劑)和UL37(線粒體凋亡抑制，vMIA)同源基因的突變能夠阻止Fas介導的在HeLa細胞中的細胞凋亡[14]。

HCMV的UL111A開放閱讀框架與人IL-10呈現高度同源，HCMV表達病毒源性IL-10是其免疫逃避的重要機制之一[15]。RhCMV中也發(fā)現了IL-10表達，呈現出針對宿主體液免疫的抑制性[16]。與HCMV IL-10類似，RhCMV能在獼猴體內表達病毒源性IL-10(cIL-10)，它與獼猴宿主表達的IL-10有25% ～ 27%的同源性，因此，自然感染RhCMV的獼猴中可檢測到抗病毒IL-10的抗體[17]。HCMV的MHC-I表達下調機制，是其另一個重要的免疫逃避機制，RhCMV的US2、US3、US6、US11基因組里有相似的基因家族[18]，而嚙齒類動物US2 ～ US11基因家族則無類似的免疫逃避機制。RhCMV-US28.5編碼一個包含五個同源基因的突變病毒趨化因子受體，與人類HCMV-US28同源，而嚙齒類無此基因。靈長類動物特有的七跨膜結構域基因家族，可進一步顯示HCMV和RhCMV的同源性[19]。

雖然對HCMV感染的保護性免疫應答的性質尚不完全確定，HCMV誘導的病毒特異性免疫必須被視為宿主保護機制。通過對病毒自然感染史的研究，證實HCMV反復機會性感染誘導的中和抗體和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應，能有效抑制HCMV感染升級和CMV相關疾病發(fā)生[20]。RhCMV誘導猴宿主的免疫保護性反應與人類一致。磷酸化蛋白65(pp65)是HCMV免疫反應的主要目標之一，RhCMV-pp65-2定位于細胞核，也是獼猴體液免疫和細胞免疫的目標[21]。在健康獼猴中，RhCMV特異性CTL反應也具有MHC-I限制性，其靶蛋白Rh-IE1和Rh-IE2，與HCMV靶蛋白同源[22]。此外，RhCMV的特異性中和抗體的時間變化曲線和人HCMV也高度相似，且中和抗體的靶蛋白也均為病毒殼表面的糖蛋白(GB)。體外處理克隆的RhCMV GB和HCMV GB其水解產物相近，且存在抗體交叉反應[23]。存在于免疫系統的靶向IE1/IE2，GB和pp65使RhCMV成為研究CMV疫苗的可行模式。

2 免疫功能低下患者的HCMV感染和RhCMV感染的免疫狀況

HCMV感染在健康人身上通常無癥狀，但此病毒是免疫功能不成熟或低下患者的發(fā)病和死亡的重要病因之一，也是艾滋病和移植受體機會性感染常見的危及生命的并發(fā)癥[24]。免疫功能低下時免疫系統已經不能控制HCMV的原發(fā)感染或潛伏期的再激活。HCMV先天感染是美國出生缺陷傳染病原因的重要原因，僅在美國，與巨細胞病毒病有關的衛(wèi)生保健費用就超過每年44億美元[25]。免疫系統功能低下的獼猴也能觀察到嚴重的RhCMV病。實驗接種病毒的獼猴胎兒，中樞神經系統發(fā)生異常的風險與胎盤的母體IgG轉移到胎兒的RhCMV免疫反應呈負相關[21]。監(jiān)測類似于人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染過程的RhCMV的反應，在攜帶RhCMV的獼猴上構建猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)感染模型，隨之進行免疫抑制能夠產生特征性RhCMV播散病變，與人類移植受體和HIV患者的HCMV播散方式高度雷同[25]。總之，無論是人類還是獼猴，宿主免疫功能和CMV之間的博弈結果，決定了CMV感染的臨床結局。在針對宿主抗移植物的研究中，研究者擬應用抗CD40和CD28抗體延長移植腎的存活時間，有趣的是，在獼猴上應用CD40/CD28抗體后，RhCMV再感染被顯著激活，出現播散性CMV病[26-27]，這與下文講到的“CMV-免疫衰老”悖論相關。

3 免疫衰老的“健康”個體的HCMV感染和免疫衰老的相關性探究

免疫衰老的“健康”老年人，本身即存在一個邏輯悖論。因為衰老的退行性變是一個基因調控的不可逆過程，免疫系統也不能獨善其身。在一個健康的老年個體中，免疫功能無異常和年輕免疫活性的免疫系統仍存在很多差異，而健康衰老的定義，目前仍是一個極大的挑戰(zhàn)。一方面，持續(xù)終生的HCMV反復再感染誘導的免疫反應，可能是老年個體免疫衰老的重要責任病原體。老人宿主外周血中，一半以上的效應記憶T細胞(effector memory CD8+T cells，EM CD8+T cells)均為HCMV特異性的T細胞。這種HCMV特異性T細胞的高度克隆化的累積效應，“壓縮”了外周血初始T細胞的數量，使老年個體針對新抗原的識別能力和T細胞受體(T cell receptor，TCR)多樣性降低。另一方面，來自相對健康的高齡老人人群的流行病學數據顯示，HCMV的反復再激活與預期壽命呈現顯著正相關，而不是預測的負相關，因此還有研究者推測HCMV在老年個體免疫衰老的漫長進程中，可能發(fā)揮一個“低水平疫苗樣炎性刺激”作用，進而避免了老年個體遭受高致病性新病原體感染后的“免疫休克時間窗”，從而降低了衰老個體的死亡率[28]。

4 靈長類動物模型在HCMV誘導免疫衰老機制中的重要性

CMV的進化變異與物種相關性具有平行關系，靈長類動物的CMV基因組與嚙齒類動物病毒基因組相比，其相互關聯性顯著增高。最廣泛使用的鼠CMV(MCMV)解決生物學和免疫學的很多基本問題，但是和HCMV基因組有很多不同，MCMV存在許多“非必需基因”[29]。此外，免疫衰老作為一個衰老個體發(fā)生的增齡性退行性改變，也是進化壓力產生的調適性改變。HCMV誘導的免疫衰老最重要的表型之一是CD28的丟失，HCMV特異性CD28nullCD8+T細胞的增高，是人類免疫衰老風險表型群的獨立風險因素之一[30]，鼠的T細胞表面的CD28從不丟失，這降低了鼠模型在免疫衰老中的研究價值[7]。HCMV潛伏于骨髓中無法清除，是HCMV終生反復感染的最重要機制，目前的研究重點已經從HCMV的反復再激活，前推到HCMV在骨髓干細胞的潛伏階段。既往應用原代細胞和體外細胞系的實驗感染，已經證實了分子水平上HCMV基因表達復雜調控的斷面網絡，這些研究主要集中在MIE基因即時表達調控[31-32]。因為干細胞的HCMV再激活表型的關鍵在于MIE基因的表達從靜止變?yōu)橛|發(fā)，細胞轉錄抑制因子通過組蛋白翻譯后的修飾，構建一個染色質結構依賴的轉錄抑制機制，相關問題還有很多，例如：HCMV長期在髓系細胞中攜帶，這個潛在的基因組如何維持呢？它們生命的某個階段，是否發(fā)生增殖？HCMV潛在的復制起點是什么？HCMV基因組運輸和重新激活高度被限制是如何實現的？最近的研究表明UL84可維持病毒序列，一批具有強大的長期抗凋亡功能的細胞蛋白在潛伏感染的CD34+細胞中上調，提示HCMV擁有一個與眾不同的抗凋亡體系[33]。伴隨基因表達技術的高速發(fā)展，越來越多的證據提示HCMV潛伏其實是一個高度活躍的過程，其中涉及延遲特定基因產物以及定時編排，這些編排時間相關性變化幫助病毒維持潛伏感染，調節(jié)HCMV潛伏的骨髓內干細胞的內環(huán)境以利于病毒的潛伏。HCMV攜帶細胞骨髓干細胞的獲取，在臨床上缺乏實踐性。通過在獼猴干細胞獲取染色質表型，以及多種組學的同步研究，對明確HCMV的潛伏再激活機制，從潛伏期抑制病毒再激活，從而阻斷免疫衰老的核心途徑，都是非常有前景的假說[34]。

綜上，研發(fā)RhCMV作為人類巨細胞病毒的動物模型的時代已經到來。恒河猴動物和細胞模型已應用了許多關于基因組細菌編輯、細胞標記和人工染色體突變的先進技術，由于成本和近親繁殖淘汰率高的原因，靈長類不會取代小鼠在巨細胞病毒生物學和免疫學的應用，但對于許多重要的科學問題，如疫苗研制、藥物開發(fā)、潛伏的CMV感染與免疫衰老，非人靈長類正迅速成為首選動物模型。