細胞焦亡在慢性肝臟疾病中作用的研究進展

楊 祥，開 鈞，王志敏，張晨曦，邵江娟，張 峰，鄭仕中

(南京中醫藥大學1.藥學院、2.江蘇省中藥藥效和安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023)

隨著生活水平的提高，人們飲食結構發生改變，作為人體最大的代謝器官肝臟發生病變的幾率也逐漸增大。慢性肝病患者首先發生肝細胞脂肪變性，并伴隨著炎癥的發生，進而發展為肝纖維化，肝臟形成代償性瘢痕組織，更嚴重的形成肝硬化，甚至發展為肝癌，最終造成患者的死亡[1]。近年來，研究發現，細胞焦亡廣泛存在于慢性肝臟疾病發生過程中，抑制多種肝臟細胞焦亡的發生可以降低肝損傷時肝細胞的損傷程度，減少炎癥因子的生成和炎癥反應[2-3]。除此之外，焦亡細胞產生的炎癥因子IL-1β能夠誘導肝星狀細胞活化，對肝纖維化的發生發展有著促進作用[4-5]。因此，細胞焦亡在非酒精性脂肪肝病、酒精性脂肪肝病、病毒性肝炎、肝纖維化、肝癌等肝臟疾病的發生和發展中可能發揮著重要的作用，本文總結了多種類型細胞焦亡在慢性肝臟疾病中的作用，為治療慢性肝臟疾病提供新的思路和方法。

1 細胞焦亡

焦亡是細胞程序性死亡中一種炎癥性死亡形式，焦亡與凋亡存在著明顯差異，凋亡的發生主要依賴于半胱天冬酶caspase-3、6、8等，伴隨著凋亡小體形成，細胞內容物由細胞膜包裹，而后由巨噬細胞對其進行非炎癥性吞噬。而焦亡則依賴于半胱天冬酶caspase-1、4、5、11，過程中細胞脂質雙分子層膜上形成孔腔，細胞破裂，胞內炎性物質釋放誘發局部炎癥反應。細胞焦亡是一種由各種各樣的刺激，包括入侵的細菌、細胞內病原體等引發的機體自身防御機制。其中脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS)作為細菌的重要生成物，不僅能夠刺激機體產生免疫反應，也是誘導細胞發生焦亡的重要因子[6]。正常情況下，焦亡是一種有利于機體的適應性免疫反應，從宿主體內清除細胞內的病原體，將感染性細菌呈遞給中性粒細胞等免疫細胞，免疫細胞通過釋放的細胞因子殺傷感染性細菌和細胞內病原體，而焦亡的過度激活則會導致細胞大量死亡、組織損傷、器官衰竭和致命的敗血性休克[7]。

1.1經典炎癥小體介導的細胞焦亡細胞主要通過經典炎癥小體通路來誘導自身焦亡。炎癥小體通常是由Nod樣受體(nod like receptor, NLR)、適配器蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)和pro-caspase-1所構成的小分子多蛋白復合物[8]。適配器蛋白ASC含有caspase 募集結構域(caspase recruitment domain, CARD)和熱蛋白結構域(pyrin domain, PYD)，能夠作為雙重接頭蛋白分子，通過CARD-CARD和PYD-PYD 相互作用，將含有PYD結構域的NLR與含有CARD結構域的pro-caspase-1連接起來，二聚體形式的pro-caspase-1裂解為p10、p20 亞單位，形成具有催化活性的caspase-1，誘導IL-1β和IL-18的成熟，從而介導細胞焦亡的發生。已知能夠形成炎癥小體的NLR家族成員有NLRC4、NLRP1、NLRP3以及AIM2。微生物的特殊結構作為病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)，以及損傷的宿主細胞通過釋放損傷相關分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)，誘導細胞內炎癥小體的形成[9]。經典炎癥小體的形成是焦亡過程中關鍵的環節，影響炎癥小體的組裝與活化能夠作為調控細胞焦亡的重要方式。

1.2非經典炎癥小體介導的細胞焦亡近年來，非經典炎癥小體因為其獨特的形成方式而區別于其他經典炎癥小體。革蘭陰性菌通過形成外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMV)，將LPS遞送到細胞表面，通過細胞內吞作用將LPS包裹在內涵體中進入細胞，LPS在細胞中釋放，促進caspase-11的活化[10]。在小鼠體內，pro-caspase-11與LPS尾部的脂質體A通過直接的相互作用結合在一起，而人體中，作為caspase-11同源體的caspase-4/5也是通過相似的方式，直接與細胞內的LPS相互作用形成非經典炎癥小體，從而促使細胞發生焦亡[11]。

1.3GSDMD介導的細胞焦亡炎癥小體發現后，它們是如何誘導細胞焦亡的機制依舊不清楚，人們逐漸將目光集中在其下游的目標靶點。Kayagaki等[12]和Shi等[13]幾乎在同一時間確定了GSDMD是caspase-11下游的底物蛋白。GSDMD屬于一個被稱為gasdermin的功能未知的蛋白家族，該家族還包括GSDMA、GSDMB、GSDMC、DFNB59(GSDME)等。GSDMD在caspase-11的保守域D276被分割成一個N末端p30(GSDMD-N結構域)和一個C末端p20(GSDMD-C結構域)。GSDMD-N能夠特異地結合磷酸化磷脂酰肌醇或心磷脂，而這兩種物質分別是真核細胞和原核細胞膜上特有的磷脂。GSDMD-N分子通過這種方式結合到細胞膜，隨后發生寡聚化，16個該分子形成內徑約為10～14 nm的孔道[14]。炎癥小體通路產生的炎癥因子IL-1β和IL-18，以及K+，通過這一孔道分泌到細胞外，同時Ca2+大量流入，造成滲透壓和電化學梯度，細胞外的水大量進入細胞，造成細胞破裂死亡。因為GSDMD-N蛋白在細胞膜上形成的孔道在細胞焦亡中發揮的重要作用，成為一種關鍵蛋白，調控著細胞焦亡的進程。

2 細胞焦亡與肝臟疾病

人體肝臟是由肝臟實質細胞(肝細胞)和非實質細胞(non-parenchymal cells, NPCs)構成，其中非實質細胞主要包括肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSCs)、枯否細胞(Kupffer cells，KCs)、肝竇內皮細胞(liver sinusoidal endothelial cells, LSECs)、中性粒細胞、樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)等，肝臟發生疾病時，往往伴隨著多種細胞的病理性變化。近年來，焦亡作為新的細胞程序性死亡方式，因為其特殊的病理特征越來越受到人們的關注。細胞焦亡主要是由于細菌產生的LPS誘導發生，人體胃腸道中存在有大量的細菌，通過肝腸軸對肝臟產生重要影響。不健康的飲食方式，尤其是長期酗酒和高脂飲食，往往會造成腸道菌群的失衡，細菌通過血液到達肝臟，并誘導肝臟組織發生病變。正常狀態下，焦亡過程中所必需的炎癥小體主要存在于肝臟KCs、LSECs中，部分存在于門靜脈竇周圍的肌成纖維細胞和HSCs中，而在肝細胞中幾乎不存在。但在LPS的刺激后，肝臟HSCs和肝細胞中出現大量活化的炎癥小體[15]。研究發現，肝臟KCs、中性粒細胞、DCs和肝細胞都能發生焦亡。焦亡細胞分泌的IL-1β和IL-18可以誘導炎癥反應，造成肝臟損傷，其中 IL-1β 不僅能夠影響IL-1R1，JNK和AP-1 通路，提高HSCs的增殖能力[5]，還可以直接誘導肝細胞脂肪變性，增強肝細胞炎癥反應[16]。炎癥小體作為胞內物質被釋放到細胞外，能夠活化存在于細胞外間隙的 caspase-1 前體，周圍正常的巨噬細胞通過內化這些游離的炎癥小體，促進胞內caspase-1的活化[17]，表現為細胞之間焦亡的相互影響。另外，通過體內特異性敲除GSDMD，有利于緩解慢性肝臟疾病中肝組織的脂肪變性和炎癥反應[18]。因此，炎癥小體以及GSDMD介導的細胞焦亡可能在肝臟疾病的發生、發展過程中發揮著重要作用。

2.1細胞焦亡與非酒精性脂肪肝病(non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD) NAFLD是指除酒精和其他明確的肝損傷因素外，所致的肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，其范圍包括早期的單純脂肪變性、非酒精性脂肪肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)，以及發展形成的肝纖維化、肝硬化和肝癌。肝細胞死亡能夠引發細胞炎性反應，因此，減少肝細胞死亡有利于緩解脂肪肝病的進展。焦亡作為細胞一種炎癥相關的程序性死亡方式，有效地抑制其在肝臟中發揮的作用可能成為NAFLD潛在的治療方式。

Xu等[18]發現，在發生NAFLD/NASH的人類肝臟組織中，GSDMD和焦亡過程中誘導的GSDMD-N蛋白表達明顯升高。蛋氨酸/膽堿缺乏飲食(methionine/choline deficient diet, MCD)方式喂養的GSDMD-/-小鼠與野生小鼠相比，表現出脂肪變性和炎癥程度明顯降低，并且脂肪生成基因SREBP-1c表達減少，脂肪降解基因PPARα、ACO、LCAD、Cyp4a10和 Cyp4a14表達增加；體外實驗，在AML-12肝細胞中過表達GSDMD-N，肝細胞在MCD處理后的損傷程度增加。GSDMD在NASH病理過程中控制著IL-1β、TNF-α和單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)等細胞因子的釋放，以及NF-κB的活化和脂肪生成。MCC950作為一種NLRP3選擇性抑制劑，能夠抑制膽固醇晶體介導的KCs、骨髓來源的巨噬細胞NLRP3活化，阻止MCD模型中肝臟caspase-1和IL-1β的增加，降低巨噬細胞和中性粒細胞的數量，達到改善肝纖維化的作用。NLRP3-/-小鼠的MCD模型與野生型小鼠相比較，非酒精性肝炎的程度更低[2]。硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein, TXNIP)與NLRP3在NASH過程中形成復合物，TXNIP缺乏能夠促進NLRP3炎癥小體的活化。由此，推斷TXNIP結合抑制NLRP3活化，起到抗炎和保護細胞的作用[3]。此外，小分子化合物AS-1通過抑制ASC和NLR的結合來阻礙炎癥小體的形成，也具有減緩NASH和肝臟胰島素抵抗的作用[19]。

由此可見，抑制炎性小體復合物的合成與活化過程，或者減少焦亡過程中的關鍵蛋白GSDMD的表達來抑制焦亡的發生，能夠減弱肝臟細胞焦亡后引起的肝臟炎癥反應、組織損傷和脂肪變性的現象，具有一定減緩NAFLD的作用。

2.2細胞焦亡與酒精性肝病(alcoholicliverdisease,ALD) ALD是全世界慢性肝病和導致肝纖維化、肝硬化的一個主要誘因。ALD包括酒精性脂肪肝炎(alcoholic steatohepatitis, ASH)、酒精性肝炎(alcoholic hepatitis, AH)、酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化。酒精導致的肝臟損傷機制錯綜復雜，其中包括酒精代謝產物乙醛毒性、氧化應激、線粒體功能障礙、炎癥反應等等，而焦亡發生時常常伴隨著肝臟局部炎癥反應，同時，肝細胞能夠通過促炎因子IL-1β和IL-18，與各種免疫細胞產生細胞間的交流，對肝臟ALD的發生、發展產生重要影響[20]。

Khanova等[21]在探究ASH轉化為AH的過程中，發現在小鼠和人體AH肝臟中，非經典炎癥小體caspase 11/4表達上調，caspase 11/4在完成切割后，使GSDMD活化，并誘導細胞焦亡以應對細胞內PAMPs。而在AH模型中，直接在肝細胞中過表達成熟的GSDMD，能夠增加肝細胞死亡數量和炎性細胞浸潤。結果表明，caspase 11/4-GSDMD信號通路誘導的肝細胞焦亡在ASH轉化為AH的病理過程中具有重要作用。實驗還發現[16]，致病劑量的IL-1β能夠誘導肝細胞脂肪變性，增強肝細胞炎癥反應，增加MCP-1的表達。ALD伴隨著脂肪變性和促炎性因子的上調，其中炎癥因子IL-1β也是細胞焦亡重要產物。炎癥因子不僅會誘發焦亡細胞自身炎癥反應，還可以對周圍正常細胞產生影響，形成一個惡性循環。因此，通過抑制炎癥小體的形成和GSDMD的表達，減少肝臟細胞的焦亡，能夠減輕酒精誘導的肝臟炎癥反應、脂肪變性和組織損傷。

2.3細胞焦亡與病毒性肝炎病毒性肝炎是由肝炎病毒引起的肝臟傳染性疾病，嚴重的病毒性肝炎也會發展成肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌。研究發現，KCs在LPS刺激后表達大量的NLRP3和成熟的IL-1β，而慢性HBV感染能夠抑制LPS誘導的NLRP3和IL-1β的表達及IL-1β的成熟，該過程涉及到NF-κB信號通路的抑制和活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)的產生[22]。Kofahi等[23]探究HCV感染是如何導致肝臟衰竭時，檢測HCV感染Huh-7.5細胞后誘導的細胞程序性死亡方式，發現HCV不僅能夠誘導caspase-3介導的凋亡，還可以誘導caspase-1介導的細胞焦亡，且這兩種程序性死亡的發生不僅僅局限于受感染的細胞，也能夠影響周圍正常細胞，誘導它們發生凋亡或焦亡。進一步研究HCV與肝臟細胞焦亡關系，能夠增加人們對肝炎病毒誘導肝臟疾病產生機制的認識。

2.4細胞焦亡與肝纖維化肝纖維化是指在肝臟受到外來刺激時，存在于肝組織Disse間隙中的HSCs活化增殖，并分泌大量的細胞外基質(extracellular matrix, ECM)，ECM合成和降解失衡，導致肝內纖維結締組織異常沉積而形成瘢痕組織的一種代償性疾病。肝纖維化也是NAFLD、ALD、肝硬化及肝癌共同的病理過程。研究表明，炎癥小體的活化能夠導致肝細胞的焦亡，并能進一步誘發肝臟炎癥和肝纖維化[24]。

肝組織損傷時，壞死的肝細胞能夠募集嗜酸粒細胞，導致其分泌IL-1β和IL-18，甚至死亡，同時進一步誘發肝細胞的死亡、周圍組織炎癥和肝纖維化的產生與發展，而這一過程可以通過caspase-1抑制劑來抵消，表明浸潤的嗜酸粒細胞通過發生焦亡對肝細胞產生影響，并且能夠誘導肝纖維化的發生。體外實驗中，LPS刺激的巨噬細胞RAW 264.7通過旁分泌IL-1β、IL-18和TNF-α，促進LX-2細胞中pro-IL-1β的形成和切割，并且誘導小鼠HSCs的活化和膠原蛋白的形成[25]。此外，分別將GSDMD-/-和WT小鼠用MCD方式飼養8周，誘導肝纖維化模型，發現WT組小鼠肝臟中α-SMA和轉化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)mRNA水平更高，GSDMD-/-小鼠肝臟羥脯氨酸含量明顯減少，表明GSDMD對MCD誘導的肝纖維化的發展具有重要作用[18]。

HSCs中存在少量的炎癥小體，有研究表明，抑制HSCs中炎癥小體的形成能夠下調HSCs活化時重要指標膠原蛋白和α-SMA含量，以及ECM的形成與沉積[26]，但其自身能否發生焦亡還需要進一步研究。活化的HSCs分泌大量的ECM是導致肝纖維化的重要原因，肝細胞及Disse間隙中非實質細胞發生的異常焦亡可能對HSC的活化產生促進作用。因此，進一步探究肝臟細胞焦亡產生的具體影響，對研究肝纖維化進程與發展具有重要意義。

2.5細胞焦亡與肝癌肝癌作為全球范圍內嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤疾病之一，通常是繼發于慢性肝臟疾病。靶向介導肝癌細胞的死亡一直是治療肝癌的重要手段，焦亡作為一種新的細胞程序性死亡方式，可能是繼細胞衰老、凋亡后新的治療肝癌的方法。與正常肝臟組織相比較，在肝癌發展的不同階段，肝癌組織中NLRP3的表達明顯變低[27]，意味著肝癌細胞發生焦亡的可能性降低。最近還發現，GSDME(DFNA 5)能夠將TNF-α或者是化學藥物誘導的細胞凋亡轉化為焦亡，并且GSDME在絕大多數腫瘤細胞中是沉默的，而在正常肝臟中表達[28]。因此，進一步研究細胞焦亡，對肝臟腫瘤的預防和治療具有重要意義。

3 結語

肝臟作為人體最重要的器官之一，長期酗酒以及不健康的飲食和生活方式會導致NAFLD、ALD的發生，加上全球病毒性肝炎的日益蔓延，肝臟的健康受到了極大的挑戰。如果缺乏有效的干預治療，慢性肝病由早期的纖維化會逐漸轉變為肝硬化，甚至是肝癌，直接威脅患者的生命。肝臟疾病發生時伴隨著炎癥小體的激活和炎性介質IL-1β和IL-18的釋放，以及GSDMD的表達增加。焦亡作為一種炎性相關的程序性死亡方式，主要通過PAMPs或者DAMPs方式，激活caspase-1/4/5/11相關的炎性小體，并促使GSDMD-N生成，誘導細胞的脹破，細胞內容物及炎性介質釋放。已經發現，肝臟中KCs、DCs、中性粒細胞等免疫細胞和肝細胞均能發生焦亡。正常生理狀況下，焦亡作為機體免疫的一部分，具有呈遞和吞噬病原體的積極作用，而過度的細胞焦亡則會導致大量細胞死亡，對肝臟組織生理結構和功能產生破壞。焦亡細胞分泌的物質通過細胞之間的交流，影響著周圍正常細胞，其中IL-1β誘導的HSCs大量活化將直接加快肝纖維化的進程，對慢性肝病的發生、發展具有促進作用。然而，目前細胞焦亡調控肝臟疾病的機制尚不清楚，還需要我們進一步研究，該領域的探索能夠為預防和治療慢性肝臟疾病提供新的方法和策略。