miR-369-5p對SD大鼠心肌成纖維細胞活化增殖的影響

代 晨，陶 輝，石開虎，徐盛松

(安徽醫科大學1.第二附屬醫院心胸外科；2.心血管病研究中心，安徽 合肥 230601)

心肌纖維化是各種因素作用于心臟，引起持續性心肌損傷的病理改變過程，是心肌重構的重要特征，也是許多常見心血管疾病的病理基礎，其主要表現為心肌細胞外基質中膠原纖維過量積聚及膠原成分的改變[1]。心肌纖維化在心房顫動的發生、發展中起重要作用，是心房顫動的重要結構基礎，嚴重威脅著人類的健康[2]。目前，心肌纖維化形成的具體機制尚未明確，但已明確心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts，CFs)的活化增殖是心肌纖維化形成的重要環節。心肌間質主要由CFs構成，其表型可轉換為肌成纖維細胞，進一步活化、增殖，并合成、分泌膠原纖維蛋白[3]。另有研究表明，微小核糖核酸(microRNAs，miRs)參與心血管系統疾病的生理及病理過程，miRs是一類內源性、短鏈、非編碼的單鏈RNA[4]。文獻報道，miRs可參與調控心肌纖維化的發生、發展[5]，miR-369-5p作為miRs中的成員，可以誘導DNA組蛋白修飾的表觀遺傳重編程和去甲基化[6]，而甲基化又與心肌纖維化之間存在著密切的關聯[7]。國內外學者對心肌纖維化和miRs進行了大量研究[8]，但miR-369-5p與心肌纖維化之間的作用關系研究尚未見報道。本研究以miR-369-5p為切入點，通過觀察其對CFs活化增殖的影響，探討miR-369-5p的可能作用機制，為心肌纖維化的預防和治療找到可能的潛在靶點。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 40只♂ Sprague-Dawley(SD)乳鼠，清潔級，體質量10 g左右，鼠齡3 d左右，購于安徽醫科大學動物實驗中心，動物許可證號：scxk(皖) 2017-001。

1.1.2試劑 DMEM培養基、DMSO、CCK-8相關試劑(美國Sigma公司)；胎牛血清(Gibco公司)；microRNA-369-5p模擬物、microRNA-369-5p抑制物轉染試劑盒、Ez Omics One-Step qPCR試劑盒、U6 snRNA qRT-PCR試劑盒、Hairpin-it miRNA qRT-PCR試劑盒(吉瑪公司)；逆轉錄試劑盒、SYBR PremixExTapⅡ(2×) (TaKaRa公司)；TRIzol試劑、LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)；引物由上海生工生物工程有限公司合；Ⅰ型膠原前膠原A1(type I collagen procollagen A1，Col1A1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、β-actin的一抗(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.1.3儀器 HR30-ⅡA2型生物安全柜(青島海爾特種電器有限公司)；二氧化碳培養箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Step One PCR擴增儀(美國ABI公司)；分光光度儀(德國Implen Gmb H公司)；TU-100恒溫金屬浴(上海一恒科技有限公司)；MK3酶標儀(荷蘭雷勃公司)；倒置相差顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2方法

1.2.1SD乳鼠CFs的提取與培養 SD乳鼠用乙醇浸泡消毒30 s后處死，轉移至超凈臺,取出心臟，用PBS緩沖液沖洗數遍，洗凈血塊。將洗過后的心臟轉移至5 mL滅菌EP管中，用剪刀充分剪碎，加入3 mL的混合酶液(胰蛋白酶 ∶Ⅰ型膠原酶比例為2 ∶1)水浴鍋中消化，隨后靜置1 min，緩慢抽取上清液加入新滅菌離心管，再向其中加入等量的含血清DMEM培養基中和酶的消化，900 r·min-1離心8 min，重復操作3次，使組織塊消化充分，得到混合細胞，向各離心管中加入1 mL含10%胎牛血清的DMEM培養基，輕輕吹打數次，轉移到培養瓶中，在培養箱中放置1.5 h后，換液貼壁的細胞即為CFs。顯微鏡下觀察通過細胞形態學鑒定CFs，隨后將細胞放入細胞培養箱中，繼續培養傳代，至3～4代可用于實驗，顯微鏡下觀察到應用纖維黏連蛋白免疫組化染色陽性者即為CFs。

1.2.2實驗分組 實驗組：CFs瞬時轉染miR-369-5p模擬物及抑制物；空白對照組：CFs不作轉染處理；陰性對照組：CFs瞬時轉染空載體質粒，不會對基因表達產生任何影響。

1.2.3細胞轉染 CFs培養至對數生長期時可以進行轉染實驗，將CFs消化后計數，等量接種至6孔板上，次日貼壁后進行轉染操作。實驗組miR-369-5p模擬物上游引物：5’-AGAUCGACCGUGUAUAUUCGC-3’,下游引物：5’-GAAUAUAACACGGUCGAUCUUU-3’； miR-369-5p抑制物的引物序列：5’-GCGAAUAUAACACGGUCGAUCU-3’；陰性對照組的引物序列：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。按照LipofectamineTM2000 Reagent 和miR-369-5p試劑盒的說明書對各分組的CFs進行細胞轉染實驗，培養4～6 h，再更換常規培養基培養，分別于24、48 h進行細胞總RNA的提取。

1.2.4提取總RNA及逆轉錄 提取細胞總RNA，分光光度儀測定RNA的濃度和純度，選擇適宜的RNA樣本逆轉錄為cDNA。按照miRNAs試劑盒說明書操作加樣，進行逆轉錄反應和實時熒光定量PCR，檢測miR-369-5p的表達。逆轉錄反應條件為：25℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，最后4℃保存。取cDNA進行microRNA實時熒光定量PCR反應：預變性95℃ 3 min，PCR反應95℃ 12 s，62℃ 40 s，共進行40個循環的擴增。最后用U6作為內參，根據2-ΔΔCT法計算各組mRNA的相對表達水平。

1.2.5qPCR檢測各轉染組Col1A1、α-SMA的表達 根據逆轉錄試劑盒說明書，將各轉染組總RNA逆轉錄成cDNA，用 ABI Step One Real-Time PCR系統進行反應擴增。設置反應條件為：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 20 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共進行40個循環；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s作為熔解曲線階段。β-actin設定為內參，應用2-ΔΔCT法計算mRNA 的相對表達量。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.2.6Western blot法檢測CFs中Col1A1、α-SMA蛋白的表達 轉染后的細胞繼續培養48 h，向各細胞培養瓶分別加入1 mL RIPA解液和10 μL PMSF，吹打均勻裂解細胞，提取總蛋白，測蛋白濃度后，-80℃冰箱保存備用。SDS-PAGE蛋白電泳，轉膜，TBST洗膜2次，封閉1 h，再次洗膜4次，分別孵育α-SMA、β-actin、Col1A1的一抗，4℃搖床孵育過夜，洗膜后，二抗室溫孵育1 h，洗膜4次，采用ECL法顯影。結果采用Quantity One V 4.6軟件分析，根據測定出目的條帶吸光度值，計算 Col1A1、α-SMA的蛋白表達水平。

1.2.7CCK-8試劑盒檢測轉染后CFs的增殖情況 設計分組：miR-369-5p模擬物組、miR-369-5p抑制物組、陰性對照組、空白組，每組設4個復孔。各轉染組的CFs處于對數生長期時用胰蛋白酶消化，加入DMEM中和消化，細胞計數。以細胞密度為5×106·L-1鋪于96孔板中，每孔200 μL，置于37℃、5% CO2培養箱培養，連續培養2 d。每孔加入10 μL CCK-8，避光孵育2 h后測定OD值，實驗重復3次。

2 結果

2.1瞬時轉染miR-369-5p模擬物、抑制物對miR-369-5p表達的影響如Fig 1所示，CFs瞬時轉染miR-369-5p模擬物、抑制物、陰性對照組及空白組后培養48 h，模擬物組相較于空白對照組及陰性對照組miR-369-5p的表達量明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。瞬時轉染miR-369-5p抑制物的CFs中miR-369-5p表達明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

Fig 1 qPCR analysis of miR-369-5p expression after transient transfection of miR-369-5p mimics and miR-369-5p inhibitors in CFs for 48

*P<0.05,**P<0.01vsNC and vehicle

2.2轉染miR-369-5p模擬物、抑制物對CFs細胞增殖的影響Fig 2結果顯示，瞬時轉染miR-369-5p模擬物的CFs培養48 h后，實驗組細胞活力明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；瞬時轉染miR-369-5p抑制物的CFs培養48 h后，細胞活力明顯高于空白對照組和陰性對照組 (P<0.05)。

Fig 2 Changes of MFs viability after 48 h of transient transfectionof miR-369-5p mimics and miR-369-5p

*P<0.05vsNC and vehicle

2.3瞬時轉染miR-369-5p模擬物、抑制物對Col1A1、α-SMAmRNA表達的影響如Fig 3所示，CFs 瞬時轉染miR-369-5p模擬物培養48 h后，Col1A1、α-SMA mRNA表達明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；瞬時轉染 miR-369-5p抑制物 48 h后，實驗組Col1A1、α-SMA mRNA表達明顯高于空白對照組和陰性對照組 (P<0.05)。

Fig 3 Changes of Col1A1 and α-SMA mRNA after transient transfection of miR-369-5p mimics and miR-369-5p inhibitors in CFs by

*P<0.05vsNC and vehicle

2.4轉染miR-369-5p模擬物、抑制物對CFs中α-SMA、Col1A1蛋白表達的影響如Fig 4所示，瞬時轉染miR-369-5p模擬物48 h后的CFs，Col1A1和α-SMA蛋白的表達量相較于空白對照組和陰性對照組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；瞬時轉染miR-369-5p抑制物48 h后的CFs，α-SMA、Col1A1蛋白表達相較于空白對照組和陰性對照組明顯升高(P<0.05)。

Fig 4 Changes of protein expression of Col1A1 and α-SMAin cardiac fibroblasts by Western

*P<0.05vsNC and vehicle

3 討論

在房顫心肌纖維化的發生過程中，CFs的部分表型改變及增殖活化對其有重要影響，心肌組織中有大量的CFs，而心肌細胞外基質主要由CFs合成、分泌[9]。當心肌由于各種致病因素受到損害時，CFs將會活化增殖，并轉化為肌成纖維母細胞，且能夠合成分泌大量的細胞外基質，如Col1A1、α-SMA等。因此，心肌纖維化的發生主要通過CFs的活化增殖并過度表達Col1A1和α-SMA等細胞外基質，從而使膠原的含量明顯增高，膠原纖維廣泛沉積于細胞外間質，最終導致纖維化形成[10]。

miR是一種非編碼的內源性單鏈小RNA，其由18～25個核苷酸構成,可以與靶基因mRNA 3′非翻譯區形成不完全的互補結合，進一步抑制mRNA轉錄后的翻譯，或者促進特定mRNA降解，來調控基因的表達,從而對細胞的增殖、分化、凋亡等產生影響[11]。研究表明，miR可參與調控CFs活化增殖，與心肌纖維化密切相關，然而，miR-369-5p在CFs中的活化增殖機制尚不十分清楚。本課題通過在CFs中瞬時轉染miR-369-5p模擬物和抑制物，通過與正常對照組和陰性對照組相比較，在瞬時轉染miR-369-5p模擬物的CFs中，miR-369-5p的表達明顯上升；而在轉染了miR-369-5p抑制物的CFs中，miR-369-5p的表達明顯下降。在瞬時轉染miR-369-5p模擬物組中α-SMA和Col1A1的表達下降，而在轉染了miR-369-5p抑制物組中α-SMA和Col1A1的表達水平升高。在CFs中瞬時轉染miR-369-5p模擬物 48 h后，與空白對照組及陰性對照組相比，CFs活力明顯下降；而在CFs中瞬時轉染miR-369-5p抑制物 48 h后，同空白對照組及陰性對照組相比，CFs的活力明顯增強。

綜上所述，在CFs中轉染miR-369-5p模擬物后，miR-369-5p的表達量明顯增加，而CFs的活化增殖又可被miR-369-5p的高表達所抑制，進而限制心肌纖維化的發生、發展，表明miR-369-5p是CFs 活化增殖潛在的靶分子之一。以上研究表明，miR-369-5p可能通過靶向調控下游基因的表達，進一步促進心肌纖維化，這也為探究miR-369-5p的具體作用機制提供了基礎，同時也為干預和預防心肌纖維化提供了新思路。

(致謝：本實驗在安徽醫科大學第二附屬醫院中心實驗室完成，感謝丁季飛、錢鵬、秦潤禾、汪裕琪提供的指導和幫助！)