觀察時間和換液頻率對斑馬魚評價模型的影響

高緒聰，孫程穎，韓利文，韓 建，申秀萍

(1. 天津藥物研究院新藥評價有限公司GLP實驗室，天津 300301；2. 天津市新藥非臨床評價技術工程中心GLP實驗室，天津 300301；3. 山東省科學院生物研究所藥物篩選技術重點實驗室，山東 濟南 250014)

斑馬魚作為一種公認的新型模式生物，目前被廣泛應用于醫藥、環境等多個研究領域[1-2]。在斑馬魚實驗中，檢測終點和染毒頻率不同，可能導致被檢物的毒性表現發生明顯差異，從而影響被檢物毒性的準確判斷。目前各領域對斑馬魚檢測終點的選取未形成共識[1,3-5]，染毒頻率的設定也參差不齊[2,4]。本研究針對檢測終點和染毒頻率建立驗證實驗，闡明其對斑馬魚藥物評價模型的影響，嘗試摸索最佳實驗方法，為更好地進行藥物毒性的早期篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑SZX16型體視熒光顯微鏡、DP2-BSW圖像采集系統(Olympus公司)；斑馬魚養殖飼養系統(北京愛生科技有限公司)。全反式維甲酸(all-transretinoic acid，ATRA，Sigma公司)；抗壞血酸(ascorbic acid，AA，天津市化學試劑供銷公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，生工生物工程上海股份有限公司)；三卡因(化學名3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽，Fluka公司)；鈣黃綠素(Sigma公司)。DMSO配制成儲備液，-20℃保存備用，使用前用斑馬魚胚胎培養用水(5 mmol·L-1NaCl、0.17 mmol·L-1KCl、0.4 mmol·L-1CaCl2、0.16 mmol·L-1MgSO4)稀釋為70 mmol·L-1用于實驗。

1.2魚卵制備健康性成熟的AB系斑馬魚所產受精卵，于受精2 h時經脫膜處理后，挑選受精6 h的健康脫膜斑馬魚胚胎用于實驗。

1.3實驗方法實驗共設9組，分別為空白對照組(胚胎培養用水)、溶劑對照組(DMSO，70 mmol·L-1)、陰性藥物組(AA，10 mg·L-1)、陽性藥物組(ATRA設置6個檢測濃度：0.625、1.25、2.5、5.0、7.5、10 μg·L-1)。斑馬魚胚胎移入6孔培養板中，每孔30枚，每組3個重復孔。每24 h更換4/5的藥液，連續染毒5 d。每天計數死亡受精卵和幼魚數，計算累積死亡率，對照組累積死亡率應不高于10%。實驗結束時，顯微鏡下觀察存活幼魚自主活動情況；利用1 mmol·L-1三卡因麻醉幼魚，固定焦距對側面、背面照相，首先對每條存活幼魚的形態發育進行鏡下觀察，隨后每組選擇6條幼魚對體節、脊索、尾、鰭(胸鰭、背鰭、腹鰭、尾鰭)、腦、上面部結構(眼、耳囊、嗅區)、下面部結構(上下顎)、心臟、體形、肝、鰾的發育進行評分，并根據各組織器官評分情況，對每條斑馬魚進行總體評分[6]。將麻醉的幼魚用3.2 mmol·L-1的鈣黃綠素溶液染色，熒光顯微鏡下計數魚體中具有熒光染色的脊椎骨(礦化椎骨)并拍照。

1.4觀察時間研究另取9組斑馬魚胚胎，在染毒5 d時去掉藥液，加入胚胎培養用水，至d 7結束實驗，觀察斑馬魚幼魚發育情況。其他實驗方法同“1.3”項。

1.5換液頻率研究另取9組斑馬魚胚胎，在d 1時加入藥液，實驗期間不換液，在染毒5 d時結束實驗，觀察幼魚發育情況。其他實驗方法同“1.3”項。

2 結果

2.1對死亡率的影響如Tab 1所示，空白對照組、溶劑對照組和陰性藥物組平均死亡率均<10%，但5 d不換液實驗的死亡率較換液實驗略有升高。ATRA各給藥組，給藥5 d每天換液和不換液實驗各組的死亡率均≤10%，但不換液實驗大部分組別的死亡率略低；7 d換液實驗，0.625、1.25、2.5、5.0 μg·L-1組死亡率較低，能保證有足夠數量的胚胎用于發育評價，7.5、10 μg·L-1兩組死亡率明顯升高。

Tab 1 Cumulative mortality of zebrafish(%,

**P<0.01vsDMSO

2.2對自主活動的影響空白對照組、溶劑對照組和陰性藥物組存活幼魚均能自由游動；ATRA給藥組存活幼魚，低濃度下僅部分個體游動遲緩，隨濃度增加，游動能力逐漸喪失至無法正常游動。觀察時間和換液頻率對存活幼魚自主活動的影響不明顯。

2.3對形態發育的影響3種實驗方法中，空白對照組、溶劑對照組和陰性藥物組存活斑馬魚無明顯畸形，僅見陰性藥物組個別斑馬魚的體形、尾部、胸鰭、心出現發育延遲；ATRA經梯度濃度暴露后，呈現明顯的正相關劑量-效應關系。如Fig 1所示，在給藥5 d換液實驗中，0.625、1.25、2.5 μg·L-1組斑馬魚僅鰭條有輕微的邊緣不規則，尾部輕微彎曲，頭部形態輕微異常，如腦部比例的微小變化；5.0 μg·L-1組脊索和體節不規則，靠近尾部的體節發育受阻，尾部嚴重彎曲，鰭條發育不全，頭部嗅區發育受阻，腦部發育尺寸異常，心臟、肝臟部位發育異常，鰾發育不全或不充氣，個別個體出現水腫；7.5、10 μg·L-1組嚴重畸形，水腫嚴重，脊索和體節不規則、不明晰，部分體節缺失，尾部扭曲，鰭條發育不全，兩側胸鰭嚴重異常、變小、不規則，眼睛小，上下顎、嗅區、耳蝸、腦部嚴重變形，各部位尺寸和比例失調，心臟、肝臟部位難以辨清，10 μg·L-1組比7.5 μg·L-1組畸形程度略嚴重。延長觀察時間后，5.0、7.5、10 μg·L-1組部分個體腹部或尾部出現異常增生，7.5、10 μg·L-1組水腫程度略加重，總體評分可見2.5、5.0 μg·L-1組評分降低。不換液實驗中，可見各組畸形程度略輕，5.0、7.5 μg·L-1組總體評分有所升高。評分結果見Tab 2。

2.4對骨骼發育的影響空白對照組、溶劑對照組、陰性藥物組均有一定數量的椎骨發生鈣化，7 d實驗的空白對照和溶劑對照組斑馬魚礦化椎骨數較5 d實驗有所增加。給藥5 d換液與不換液實驗中，ATRA各給藥組的礦化椎骨數均為零，可見ATRA抑制斑馬魚的骨骼鈣化，但未能體現劑量效應；在7 d換液實驗中，ATRA 0.625、1.25 μg·L-1給藥組幼魚出現少量礦化椎骨，呈現一定的劑量-效應關系。見Tab 3。

Fig 1 Development of zebrafish in ATRA treated groups

Tab 2 Total scores of zebrafish morphological

*P<0.05,**P<0.01vscontrol, DMSO and AA

Tab 3 Number of mineralized vertebrae of n=6)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsAA

3 討論

斑馬魚作為新的模型動物，具有周期短、投入少等諸多優勢，但較大鼠、小鼠、家兔等成熟動物模型，還有很多不確定因素需要摸索和探討。斑馬魚受精卵48～72 h即可孵化成魚，但剛孵出的幼魚器官發育尚不完全成形、游動能力低，不利于發育評價和自主活動的觀察。因此，本實驗基礎染毒周期和觀察時間定為受精后1～5 d，覆蓋胚胎早期發育和各器官形成期；并在5 d染毒實驗的基礎上，對斑馬魚模型的觀察終點和染毒頻率進行探討性研究。

在染毒5 d后延長觀察2 d的實驗中，斑馬魚死亡率較5 d實驗升高、形態發育畸形程度加重，可見毒性作用的延遲表達。5.0 μg·L-1染毒濃度下，ATRA對斑馬魚的致畸程度已與5 d實驗中7.5 μg·L-1基本一致，兩組總體評分相同，可見適當延后觀察終點會使評價物的毒性劑量降低、毒性等級升高，對被檢物的安全性判定更加謹慎，同時也趨向保守。另外由骨骼發育結果可知，5 d染毒實驗雖然可呈現ATRA對椎骨礦化的抑制，但由于對照組的礦化椎骨數即較少，并無劑量-效應關系，受骨骼發育階段的影響較大；將觀察時間適當延長后，可顯示不同給藥量下的劑量-效應關系，能更好地呈現藥物對骨骼發育的影響，因此在需要觀察骨骼發育情況的評價研究中，觀察終點的適當延后更加必要。

在染毒5 d不換液實驗中，兩個對照組的死亡率較換液實驗略偏高，可見換液頻率對斑馬魚的發育質量有一定的影響。同時各對照組的死亡率皆不超過10%，從一個側面說明斑馬魚對培育環境要求較低，使斑馬魚模型的廣泛推廣應用成為可能。該實驗ATRA染毒斑馬魚死亡率較換液實驗偏低、形態發育畸形程度減弱、明顯致畸劑量升高(10 μg·L-1)，可見藥物毒性作用表達不充分。同時，對照組死亡率偏高，又降低了毒性作用的檢出概率，使被檢物的毒性判定較實際偏低，增加了藥物研發的風險。

綜上所述，使用斑馬模型進行藥物毒性的早期篩選時，在染毒時間貫穿胚胎發育全程、規律重復染毒的基礎上，適當增加觀察時間有利于毒性作用的充分表達，尤其在需要進行骨骼發育評價時變得更加必要。但延長觀察時間可能使毒性劑量/濃度降低、毒作用增強，使檢測結果趨向保守，在藥物研發過程中對預期前景的瞻望應考慮該因素的影響。

(致謝：本實驗在山東省科學院生物研究所藥物篩選技術重點實驗室完成，感謝張云、何秋霞等老師的指導和幫助!)