響應面法優化超聲波輔助北蒼術多酚提取工藝及其DPPH自由基清除能力研究

陳克克,強 毅

(1.西安文理學院 生物與環境工程學院/基因工程實驗室,陜西 西安 710065;2.陜西師范大學 生命科學學院/西北瀕危藥材資源開發國家工程實驗室,陜西 西安 710119)

北蒼術(Atractylodeschinensis(DC.) Koidz.)為菊科蒼術屬植物,主產于陜西、內蒙古、河北、山西、河南、甘肅、吉林、遼寧、黑龍江等地[1-2],其干燥根莖入藥為蒼術(ATRACTYLODIS RHIZOMA)。蒼術為我國常用中藥材,具有降血壓、抗心律失常、抗腫瘤、抗潰瘍、抗菌、抗炎、利尿、保肝等作用[3-7],主要用于濕阻中焦、脘腹脹滿、泄瀉、水腫、腳氣痿蹙、風濕痹痛、風寒感冒、眼目昏澀等癥。國內、外關于蒼術化學成分的研究表明,蒼術含有揮發油、多糖、倍半萜類化合物、三萜類化合物、聚乙炔類化合物、類固醇、香豆素等活性成分[8-14],其中科研工作人員對蒼術揮發油開展了深入透徹的研究,分別從蒼術揮發油的分類鑒定、化學結構和藥理作用等方面進行了分析評價。目前，尚未見對蒼術多酚的研究報道。多酚是廣泛分布于植物體內的一類重要的次生代謝物質,化學性質獨特,藥理活性多樣,已經成為評價藥材質量的指標成分之一,在食品、醫藥保健、化學及化妝品等領域均有應用,因此對蒼術多酚展開研究十分必要。本實驗采用響應面法研究了北蒼術多酚的提取工藝，并探討了北蒼術多酚的體外DPPH自由基清除能力,以期為蒼術資源的綜合開發利用奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

北蒼術采自陜西省太白縣,經西安文理學院杜喜春副教授鑒定為菊科蒼術屬植物北蒼術,取其根部干燥后粉碎過孔徑為0.425mm篩,保存備用。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購于美國Sigma公司,純度>98.0%(質量分數);沒食子酸購于陜西標普醫藥科技有限公司,純度>98.0%(質量分數);抗壞血酸(純度>98.0%(質量分數))和甲醇、無水碳酸鈉(分析純)均購于天津市天力化學試劑有限公司;Folin-Ciocalteu試劑購于上海荔達生物科技公司。

WN-200多功能粉碎機，廣州旭朗機械設備有限公司;TE412-L型電子天平，德國Sartorius儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵，上海科恒實業發展有限公司;KH-400KDB型高功率數控超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司;三用恒溫水箱，天津泰斯特儀器有限公司;TDL-5-A型離心機，上海安亭科學儀器廠;UV-2550紫外可見分光光度計，日本島津。

1.2 實驗方法

1.2.1 北蒼術多酚的提取工藝 準確稱量5.0 g北蒼術粉末于玻璃瓶中,按液料比加入不同濃度的乙醇提取溶劑,混合均勻后放入功率為240 W的超聲波中超聲一定時間,超聲結束后真空抽濾得淺棕色濾液。

1.2.2 沒食子酸標準曲線的繪制 精密稱量標準品沒食子酸13 mg,用甲醇溶解并稀釋至50 mL棕色容量瓶中,搖勻,即得濃度為0.26 mg/mL沒食子酸溶液。

精密移取該溶液0，0.1，0.4，0.5，0.6，0.8 mL于25 mL棕色容量瓶中,分別加入蒸餾水10.0 mL,Folin-Ciocalteu試劑2.0 mL,充分振蕩搖勻后靜置8 min,再依次加入15%(質量分數)Na2CO3溶液2.0 mL,搖勻后定容,室溫下避光靜置反應2 h。以第1瓶空白溶液作參比,測定765 nm波長處的吸光度。

1.2.3 北蒼術多酚的測定 采用Folin-Ciocalteu分光光度法測定北蒼術多酚含量[15]。取北蒼術濾液50 μL,于765 nm處測定吸光度值,將該值代入沒食子酸標準曲線回歸方程,計算北蒼術多酚的濃度。按公式(1)計算北蒼術多酚的提取量,以沒食子酸當量表示。

M=(X*V1*V0)/(M1*V2)

(1)

式中：M為北蒼術多酚提取量,mg/g;X為標準曲線求出的北蒼術多酚濃度,mg/mL;V0為提取北蒼術多酚時定容后的體積,mL;V1為測定北蒼術多酚時定容后的體積,mL;V2為測定多酚時移取的北蒼術濾液的體積,mL;M1為提取北蒼術多酚時北蒼術粉末質量,g。

1.2.4 單因素實驗 以乙醇濃度70%(質量分數)、液料比25mL/g、超聲時間40 min為固定水平,考察各單因素水平對北蒼術多酚提取量的影響,以確定后續實驗的最佳提取工藝參數范圍。各因素分別設置6個水平,具體為乙醇濃度40%，50%，60%，70%，80%，90%(質量分數),液料比5，10，15，20，25，30mL/g,超聲時間10，20，30，40，50，60min。每組實驗重復3次。

1.2.5 響應面法優化提取工藝實驗設計 在單因素實驗基礎上利用響應面法設計優化超聲波輔助提取北蒼術多酚的實驗方法,選取乙醇濃度(A),液料比(B)和超聲時間(C)作為影響多酚提取優化的因素,以多酚提取量為響應值。根據Box-Behnken設計進行3因素3水平的實驗，響應面設計實驗因素及水平見表1。

表1 Box-Behnken設計因素水平及編碼表Tab.1 Levels and factors of response surface design

1.2.6 DPPH自由基清除能力 將提取得到的北蒼術多酚和抗壞血酸配成系列濃度為40，80，160，320，640，1 280，2 560和4 000 μg/mL的樣品溶液,取各濃度樣品溶液2 mL分別放置于刻度試管中,加入0.2 mmol/L無水乙醇配制的DPPH自由基溶液2 mL,混勻后室溫暗處反應30 min,517 nm波長下測吸光度值。以2 mL樣品液加入2 mL無水乙醇作為空白組,以2 mL蒸餾水加入2 mL DPPH自由基溶液作為對照組,根據公式(2)計算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A樣品-A空白)/A對照]×100%

(2)

1.2.7 數據分析 所有實驗均重復3次,實驗數據以平均值±標準差表示。運用Design Expert 8.0.6.1軟件進行響應面設計和分析,應用SPSS 17.0軟件進行數據的統計分析。

2 結果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線的繪制結果

采用沒食子酸溶液質量濃度(mg/mL)作為橫坐標,對應吸光度值作為縱坐標,繪制標準曲線,得線性回歸方程為Y=68.287X+0.003(R2=0.995 3)。

2.2 單因素實驗

圖1 乙醇濃度對北蒼術多酚提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of polyphenols

2.2.1 乙醇濃度對北蒼術多酚提取量的影響 不同濃度的乙醇對北蒼術多酚提取量的影響結果見圖1。北蒼術多酚的提取量隨著乙醇濃度的增大而增大,當乙醇濃度為70%(質量分數)時,北蒼術多酚提取量達到最大,隨著乙醇濃度的繼續增大,北蒼術多酚提取量下降。可見,70%(質量分數)的乙醇濃度可以使北蒼術多酚有較好的提取量。乙醇溶劑提取法是提取多酚類物質的常用方法,已被廣泛應用于石榴[15]、獼猴桃[16]、西藏野生卷葉黃精[17]、黔產接骨草[18]、窄葉鮮卑花[19]、米糠[20]等植物多酚類物質的提取中。不同植物含有的多酚類物質成分有差異,導致其極性不同,而不同濃度的乙醇溶劑亦有不同的極性[21],因此,提取不同植物多酚類物質應根據相似相溶的原理選用不同濃度的乙醇溶液。本實驗發現,70%的乙醇濃度可以使北蒼術多酚有較好的提取量,可能是70%(質量分數)的乙醇溶液的極性和北蒼術多酚的極性相似,故具有較大的溶解度。

2.2.2 液料比對北蒼術多酚提取量的影響 不同液料比對北蒼術多酚提取量的影響結果見圖2。北蒼術多酚的提取量隨著液料比的增加而增大,當液料比為25mL/g時,北蒼術多酚提取量達到最大,隨著液料比的繼續增加,北蒼術多酚提取量下降。可見,25mL/g的液料比可以使北蒼術多酚有較好的提取量。低濃度的液料比使北蒼術多酚提取不充分,高濃度的液料比會導致一些其他物質如多糖溶出,從而抑制多酚提取量[22],因此,合適的液料比對多酚類物質的有效提取至關重要。經查閱文獻發現,米糠[20]和石榴渣[15]多酚提取時的液料比為20mL/g,獼猴桃果皮[16]和西藏野生卷葉黃精[17]多酚提取時的液料比為25mL/g,窄葉鮮卑花[19]和黔產接骨草[18]多酚提取時的液料比分別為60mL/g和75mL/g,由此可知,不同植物多酚類物質提取所用的液料比均不同,實驗時應根據具體的實驗材料選擇合適的液料比。

圖2 液料比對北蒼術多酚提取量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the yield of polyphenols

2.2.3 超聲時間對北蒼術多酚提取量的影響 不同超聲時間對北蒼術多酚提取量的影響結果見圖3。北蒼術多酚的提取量隨著超聲時間的增加而增大,在超聲時間為40 min時,北蒼術多酚的提取量達到最大,之后超聲時間增加,北蒼術多酚提取量下降。可見,40 min的超聲時間可以使北蒼術多酚有較好的提取量。研究證明,合適的超聲時間可以讓多酚提取的過程反應完全,過長的超聲時間會因為機械力和熱能破壞多酚結構,導致多酚提取量降低[23]。以往實驗報道,超聲輔助提取獼猴桃果皮[16]和黔產接骨草[18]多酚時的超聲時間分別為25 min和50 min,本實驗發現,40 min的超聲時間可以使北蒼術多酚有較好的提取量,而采用傳統提取法提取米糠[20]、西藏野生卷葉黃精[17]和石榴渣[15]多酚時,其提取時間分別為2 h，2.5 h和3.5 h。可見,超聲提取法提取時間明顯縮短。

圖3 超聲時間對北蒼術多酚提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the yield of polyphenols

2.3 響應面法優化提取工藝

2.3.1 響應模型的建立與方差分析 利用Design Expert 8.0.6.1軟件進行Box-Behnken實驗設計,結果見表2。

對表2數據進行二次多項式回歸模型方程擬合,得到以乙醇濃度(A)、液料比(B)、超聲時間(C)為影響因素的北蒼術多酚提取量(mg/g)的回歸方程:北蒼術多酚提取量(mg/g)=11.79+0.33A+0.094B-0.075C+0.035AB-0.26AC+0.39BC-0.69A2-0.95B2-0.70C2。

根據p值可知,一次項A，交互項AC，BC和二次項A2，B2和C2對多酚提取量的影響極顯著,一次項B對多酚提取率影響顯著,影響大小順序為:乙醇濃度>液料比>超聲時間。

2.3.2 響應面優化 影響北蒼術多酚提取量各因素間的交互作用的響應曲面如圖4～6所示，可以得到乙醇濃度、液料比、超聲時間之間交互關系的直觀表現。響應曲面圖的拋物面越明顯,因素之間的交互作用越強;響應曲面圖的拋物面越不明顯,因素之間的交互作用越弱[24]。結合P值分析可知,因素間交互作用的影響為:液料比-超聲時間的交互影響>乙醇濃度-超聲時間的交互作用,而乙醇濃度-液料比間的交互作用影響不顯著。

表2 北蒼術多酚提取響應面設計及結果Tab.2 Experiment design and results for response surface analysis

表3 回歸模型方差分析表Tab.3 Analysis of variance of the regression model

注:* 表示差異顯著(P<0.05),** 表示差異極顯著(P<0.01)

2.3.3 最優提取工藝驗證 由響應面法分析數據可得出北蒼術中多酚的最佳提取工藝為:乙醇濃度為73.98%(質量分數),液料比24.86 mL/g,超聲時間36.8 min,多酚的理論最佳提取量為11.90 mg/g。

根據模型預測結果進行驗證實驗,優化實驗條件為乙醇濃度74%,液料比25mL/g,超聲時間37 min,通過3次平行試驗,求得多酚的提取量為11.67±0.15 mg/g,與理論值的誤差為1.97%,說明該回歸方程能夠真實地反映各因素對北蒼術多酚提取量的影響,可在實際生產中應用。

圖4 乙醇濃度和液料比對多酚提取量的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration and liquid-solid ratio on the yield of polyphenols

圖5 乙醇濃度和超聲時間對多酚提取量的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration and ultrasonic time on the yield of polyphenols

圖6超聲時間和液料比對多酚提取量的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time and liquid-solid ratio on the yield of polyphenols

2.4 DPPH自由基清除能力測定結果

北蒼術多酚提取液對DPPH自由基清除率的結果見圖7。由圖7可知,北蒼術多酚提取液和抗壞血酸對DPPH自由基均有一定的清除作用,且隨著其質量濃度的增加,清除率也增加,清除率最高分別可達到63.98%和96.02%。北蒼術多酚提取液對DPPH自由基的清除能力可以用DPPH自由基清除率為50%時所對應的樣品濃度(IC50)來衡量。經分析計算得出,北蒼術多酚提取液和抗壞血酸的IC50值分別為2.10 mg/mL和0.05 mg/mL,與抗壞血酸相比,北蒼術多酚提取液對DPPH自由基清除能力較弱。根據計算出的IC50值可知,北蒼術多酚提取液具有清除DPPH自由基的能力,后續可通過分離純化實驗獲得清除能力更強的多酚物質。

圖7 北蒼術多酚提取液對DPPH自由基的清除率Fig.7 DPPH radical scavenging activity of the extract of polyphenols

3 結 論

本實驗首先通過單因素試驗分析不同因素對北蒼術多酚提取量的影響,確定合適的提取條件;再采用響應面法優化超聲波輔助北蒼術多酚的提取工藝,并利用Design-Expert軟件分析了影響北蒼術多酚提取量的因素。其中，乙醇濃度和液料比對多酚提取量影響顯著,液料比和超聲時間的交互作用以及乙醇濃度和超聲時間的交互作用顯著。最終，得出其最佳提取工藝為:乙醇濃度74%(質量分數),液料比25mL/g,超聲時間37 min,在此條件下北蒼術多酚提取量達到(11.67±0.15) mg/g,且得到的北蒼術多酚具有較好的清除自由基的能力,可以作為天然抗氧化劑進行開發。超聲波輔助提取植物多酚是一種有效的途徑,利用超聲波輔助提取北蒼術多酚可為蒼術資源的綜合開發利用提供科學依據,并有利于產業化推廣,具有良好的應用前景。

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