不同中醫證型中潰瘍性結腸炎患者外周血清IL-6和IL-23表達研究

曹 蛟，劉文奇，李 舒，楊曉航*

（1.陜西中醫藥大學醫學技術學院，咸陽 712046 ；2.武漢大學基礎醫學院，武漢 430072 ）

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是炎癥性腸病中的一種，其病因不明確，主要與遺傳因素、免疫因素和環境因素有關，病變為淺表性和非特異性炎癥，乙狀結腸受累最明顯[1]。白介素-6（interleukin-6，IL-6）和白介素-23（interleukin-23，IL-23）是一些疾病炎癥反應中重要的細胞因子[2]。Allocca[3]認為IL-6與IBD以及其他慢性炎癥性疾病和癌癥發生發展密切相關的重要細胞因子。IL-23在UC的發生、發展中具有非常重要的作用，它主要由活化的單核巨噬細胞和B細胞產生。能促進T細胞、抗原提呈細胞產生 IFN-γ和IL-12 ，與炎癥反應疾病密切相關[4]。近年來，有學者發現IL-6 和 IL-23 在黏膜表達水平可反映 UC 疾病活動度[5]。

虛實辨證是中醫八綱辨證的重要內容，也是中醫臨床以“病位”和“病性”確立證候分類的基本原則。因此闡明疾病虛實證候形成的物質基礎和發病的分子病理機制，對于中醫證候本質研究、 疾病臨床治療具有重要意義。本實驗旨在研究IL-6和IL-23分別在UC不同中醫證型患者中的差異，為中醫虛實辨證UC提供物質基礎，同時也為臨床治療提供依據。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2013年1月－2014年12月在陜西中醫學院附屬醫院住院治療的UC患者31例，健康對照組6例。參照《潰瘍性結腸炎中醫診療共識意見》[6]中的標準將患者分為濕熱內蘊證7例，年齡（47.5±24.5）歲，男5例，女2例；脾胃氣虛證14例，年齡（48±23）歲，男9例，女6例；脾虛濕熱證10例，年齡（49.5±13.5）歲，男4例，女6例。另設立健康對照組6例，年齡（31±7）歲，男5例，女1例。經統計分析，各組性別、年齡構成無明顯差異（P＞0.05）。

納入臨床采集受試者入選標準：1）符合UC的西醫診斷標準；2）符合中醫脾胃氣虛證、濕熱內蘊證和脾虛濕熱證診斷標準；3）年齡在18～55歲之間；4）近一個月內無腸道感染疾病；5）近一個月內未使用抗生素及益生菌制劑；6）患者自愿簽署知情同意書；7）采樣過程符合倫理委員會要求。

排除標準：1）UC的其他中醫證候者；2）合并有代謝性疾病，如糖尿病、高血脂、高血壓、肥胖、代謝綜合征等；3）有嚴重的并發癥，如局部狹窄、腸梗阻、腸穿孔、中毒性結腸擴張、結腸癌、直腸癌及肛門疾病者；4）妊娠及哺乳期婦女；5）過敏體質及對多種藥物過敏者；6）合并肝、腎、造血系統、內分泌系統等嚴重原發病及精神病患者；7）病情危重，研究者判斷無法堅持中醫治療者。

試劑及儀器：IL-6、IL-23檢測ELISA試劑盒購自美國Immunoway公司；美國BioTek 公司ELx808酶標儀；科大創新有限公司KDC-40低速離心機。

1.2 方法

1.2.1 病例收集 根據《潰瘍性結腸炎臨床診斷指南》[7]標準，收集UC病例，并進行臨床調查。患者閱讀簽定知情同意書，確定入選排除標準，填寫基本信息、中醫癥狀評分表、既往史、治療史、合并疾病和用藥情況。對入選患者做相關檢查，對安全指標進行評估。參照《潰瘍性結腸炎中醫診療共識意見》[6]將入選的31例患者進行辨證分型，其過程由專人（附屬醫院兩位主治醫師）進行質控和辨證分型。另入選健康成人6例作為對照組。

1.2.2 IL-6、IL-23檢測 采集患者清晨空腹肘靜脈血約5 mL，室溫靜置10 min，3 000 r/min離心10 min。小心抽取血清后立即凍存于-80℃冰箱，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，分別測定IL-6和IL-23水平。1.2.3 實驗步驟 1）稀釋標準品從2000 pg/mL到0 pg/mL放入特定的離心管中。充分混勻幾次或者輕輕振蕩。向96孔板中每孔加入100 uL的已經稀釋好的標準品，室溫孵育2 h。樣本按照順序用Assay Dliuent加以稀釋，稀釋到可以檢測的濃度范圍。然后每孔加入100 uL。2）檢測抗體加入已包被的一抗吸出標準品稀釋液，每孔加入300～400 uL 1×wash bu f fer，振蕩沖洗3～4次。將稀釋detection antibody solution檢測抗體溶液（1:200稀釋）；Assay diluent，至濃度為0.4 ug/mL，充分混勻。每孔加入100 uL已經稀釋過的detection antibody solution。密封96孔板，室溫孵育2 h。3）鏈霉親和素-辣根過氧化物酶結合的生物素標記的檢測抗體。①將detection antibody solution吸出96孔板，洗板4次；②用Assay diluent將400×的streptavidin-HRP稀釋，按照1:400的比例，稀釋成1×的streptavidin-HRP solution。每孔加入100 uL室溫孵育30 min。4）液體底物顯色反應的應用，吸出1×streptavidin-HRP solution，板洗4次。每孔加入100 uL的ready –to –use substrate（底物）室溫孵育直至變色,避光。變色過程終止，迅速每孔加入100 uL的終止液，30 min后移至酶標儀檢測吸光度，波長范圍在540 nm-570 nm之間。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，多組樣本均數之間比較，采用單因素方差分析，實驗數據以均數±標準差（x± s ）表示。以P＜0.05為具有統計學意義。

2 結果

2.1 在31例UC患者中，IL-6表達水平對照組與脾胃氣虛組比較P＜0.05。而對照組、濕熱內蘊組、脾虛濕熱組之間比較均無顯著差異P＞0.05。IL-23表達水平對照組與濕熱內蘊組、脾胃氣虛組、脾虛濕熱組之間比較P＜0.01。濕熱內蘊組與脾胃氣虛、脾虛濕熱組比較P＜0.05，有統計學意義；脾胃氣虛組與脾虛濕熱組之間比較P＞0.05，兩者之間無差異性，無統計學意義，（見表1）。

表1 31例不同中醫證型UC患者外周血清IL-6和IL-23表達情況（x±s）

2.2 在UC患者中，3種中醫證候中IL-6和IL-23表達水平均高于對照組。同一種細胞因子中，不同中醫證候之間白介素表達水平不同。不同細胞因子中，脾胃氣虛組表達水平最高，其次是脾虛濕熱組和濕熱內蘊組（見圖1所示）。

圖1 31例不同中醫證型UC患者外周血清IL-6和IL-23表達情況（均值）

3 討論

炎性細胞因子在腸炎發病過程中扮演著重要的角色，現在實驗研究發現，白介素在UC的發病中關系尤為密切，可作為判斷UC治療和預后的生物指標之一[8]。Gerlach[9]認為IL-9參與調節腸道屏障功能，改變腸道的滲透性。IL-23能促進Th17細胞分泌促炎性細胞因子IL-17，參與多種慢性炎癥性疾病，而IL-17在UC腸道黏膜上的高表達與疾病的活動指數呈正相關[10]。Geremia A[11]研究表明，IL-23也作用于固有免疫系統，有助于炎性細胞因子的產生和組織炎癥細胞。有學者對UC患者血清與健康血清IL-23水平進行分析比較，發現IL-23對潰瘍性結腸炎的發病機制中起重要作用[12]。Mirsattari D[13]表明血清IL-23表達水平與潰瘍性結腸炎的持續時間和嚴重程度是直接相關的。而Taka B[14]研究發現IL-6 與炎性細胞信號通路關系密切。IL-6可直接抑制炎性細胞凋亡，促進炎性細胞過度分泌[15]。王少鑫等[16]表明IL-6表達失衡與UC的病情進展相關。周勇[17]亦表明IL-1β、IL-6、IL-8的表達水平可直接反映出UC患者的病情程度。因此,大量的國內外文獻表明潰瘍性結腸炎的發病及嚴重程度與白介素表達水平密不可分。

不同中醫證候虛實之間，白介素的表達水平亦有差異。殷銀霞等[18]在對脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎模型大鼠血清及組織中的表達中發現，脾腎陽虛型的大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ的表達水平較空白組明顯升高。楊立春等[19]對臨床180例UC患者研究發現，實證患者血清中IL-6、IL-8表達水平比虛證、虛實夾雜證高；UC患者活動期IL- 6、IL-8水平較緩解期高，這對中醫辨證分型有一定的參考價值。李麗萍[20]對臨床196例UC患者研究發現，虛證患者的IL-4表達水平明顯低于實證患者。劉紅芬等[21]對77例活動期不同中醫證型UC患者中發現實證患者IFN-γ表達水平顯著高于虛證患者，而IL-4表達水平確顯著低于虛證患者。本實驗研究發現，IL-23表達水平中，對照組與濕熱內蘊組、脾胃氣虛組、脾虛濕熱組之間比較P＜0.01。濕熱內蘊組與脾胃氣虛、脾虛濕熱組比較P＜0.05。脾胃氣虛組與脾虛濕熱組之間比較P＞0.05。IL-6表達水平對照組與脾胃氣虛組比較P＜0.05。而對照組、濕熱內蘊組、脾虛濕熱組之間比較差異無統計學意義P＞0.05，但這并不能說明濕熱內蘊組和脾虛濕熱組中IL-6的表達水平與UC無關。可能與各樣本數量、性別及年齡比例等因素有關。另外對IL- 6和IL-23表達水平和各證候進行分別比較發現，脾胃氣虛組的白介素表達水平最高，其次是脾虛濕熱組和濕熱內蘊組。這可對UC的臨床辨證分型中有一定的參考價值。

[1]孫芳美.潰瘍性結腸炎的發病機制與治療進展[J]. 中國醫藥指南, 2012(12):445-447.

[2] 曹秀紅,張學彥,張曉娜. 白介素在潰瘍性結腸炎發病機制中的研究進展[J]. 世界華人消化雜志, 2011(30):3143.

[3]Allocca M, Jovani M, Fiorino G, et al. Anti-IL-6 treatment for inflammatory bowel diseases: next cytokine, next target[J].Current drug targets, 2013, 14(12):1508-1521.

[4] 李憶嵐. 血清 IL-23 水平與潰瘍性結腸炎嚴重程度的相關性研究[J]. 中國實用醫藥, 2014 (1):3-4.

[5] 厲潔, 曲海霞, 衛紅軍, 等. 潰瘍性結腸炎患者炎癥黏膜中IL-6, L-23 的表達及其臨床意義[J]. 胃腸病學, 2011, 16(3):164-166.

[6] 張聲生, 李乾構. 潰瘍性結腸炎中醫診療共識意見 [J]. 中華中醫藥雜志, 2010, 25(6):891-895.

[7] 歐陽欽. 潰瘍性結腸炎臨床診斷指南[J]. 臨床消化病雜志,2007, 19(1):4-6.

[8] 盧藝濤, 高靜, 姚桂琴. 潰瘍性結腸炎患者相關細胞因子的實驗性研究[J]. 現代預防醫學, 2005, 32(7):735-736.

[9] G Katharina, AN Mckenzie, MF Neurath, et al. IL-9 regulates intestinal barrier function in experimental T cell-mediated colitis[J]. Tissue Barriers, 2015,3 (1-2):102.

[10] 何英, 李春明, 單景軍, 等. Th17 類細胞因子在潰瘍性結腸炎患者中的表達[J]. 中國臨床醫學, 2010, 17(4):501.

[11] Geremia A, Jewell D P. The IL-23/IL-17 pathway in in fl ammatory bowel disease[J]. 2012.

[12] Mohammadi M, Hayatbakhsh M M, Zahedi M J, et al. Serum interleukin-23 levels in patients with ulcerative colitis[J].Iran J Immunol, 2011, 8(3):183-188.

[13] Mirsattari D, Seyyedmajidi M, Zojaji H, et al. The relation between the level of interleukin-23 with duration and severity of ulcerative colitis[J]. Gastroenterology and Hepatology from bed to bench, 2012, 5(1):49.

[14] Taka B, Mihaljevi S, ?tefani M, et al. Importance of Interleukin 6 in Pathogenesis of Inflammatory Bowel Disease[J]. Collegium antropologicum, 2014, 38(2):659.

[15] 口鎖堂, 吳煥淦, 施達仁. 白介素與潰瘍性結腸炎[J]. 世界華人消化雜志, 2006, 14(4):405-411.

[16] 王少鑫 , 浦江 , 劉超群 , 等 . 炎癥因子 TNF-α, IL-6 和 IL-4在潰瘍性結腸炎中的表達及臨床意義[J]. 胃腸病學和肝病學雜志, 2015 (1):104-106.

[17] 周勇. 檢測血清 IL-1β, IL-6, IL-8 水平對于評估潰瘍性結腸炎患者病情的應用價值分析[J]. 中國中西醫結合消化雜志, 2015, 4:020.

[18] 殷銀霞 , 許雅清 , 李海龍 , 等 . IL-1, IL-6, TNF-α 及 IFN-γ在脾腎陽虛型潰瘍性結腸炎模型大鼠血清及組織中的表達[J]. 中國實驗動物學報, 2015, 2:008.

[19] 楊立春, 吳芳. 不同中醫證型潰瘍性結腸炎患者 IL-6,IL-8 水平的研究[J]. 新疆中醫藥, 2012, 30(3):11-14.

[20]李麗萍. 活動期不同中醫證型潰瘍性結腸炎患者血清干擾素和白細胞介素-4水平的變化[J]. 中國藥業, 2016,(19):30-32.

[21] 劉紅芬, 常麗麗, 周曉娜, 等. 不同中醫證型潰瘍性結腸炎患者血清干擾素-γ 和白細胞介素-4 水平的變化[J]. 中國醫藥導刊, 2008, 10(6):900-901.