拔罐療法對寒凝血瘀型家兔局部皮膚相關(guān)因子影響的實(shí)驗(yàn)研究

劉華朋，楊 靜，朱成慧，李丹丹，樸盛愛，孟向文

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.南陽市第一人民醫(yī)院兒二科，河南 南陽 473000；3.天津市濱海新區(qū)大沽社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，天津 300450；4.天津市第四中心醫(yī)院，天津 300143；5.煙臺鳳凰山醫(yī)院，山東煙臺 264003；6.天津中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，天津 300193）

2016年里約熱內(nèi)盧奧運(yùn)會，在美國游泳隊(duì)和體操隊(duì)的明星效應(yīng)下，國際運(yùn)動界帶起一股“拔罐熱”[1]。拔罐療法是中醫(yī)學(xué)的重要組成部分，在中國經(jīng)歷了數(shù)千年的積淀與發(fā)展，內(nèi)涵深邃，具有系統(tǒng)的理論體系、豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)及顯著的臨床療效，是一種兼保健與治療的自然療法，因其取材簡便，療效獨(dú)特，臨床應(yīng)用廣泛，是中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的寶貴財(cái)富[2-3]。中醫(yī)手法包括拔罐療法是調(diào)理人體"亞健康"狀態(tài)最適宜的手段,在人類健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中發(fā)揮巨大的作用[4]。目前國內(nèi)關(guān)于拔罐療法的研究大多集中在臨床療效上，但有關(guān)拔罐療法作用機(jī)制研究相對不足[5]，主要集中在罐斑、血流量、免疫影響等方面。本實(shí)驗(yàn)選用家兔拔罐局部皮膚相關(guān)因子的變化作為寒凝血瘀證研究的指標(biāo)，以闡述拔罐療法從局部到整體良性調(diào)整的部分作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及儀器 1） 實(shí)驗(yàn)動物：中國實(shí)驗(yàn)用家兔20只，體質(zhì)量（2±0.2）kg，雌雄不拘。動物在實(shí)驗(yàn)前在天津中醫(yī)藥大學(xué)動物飼養(yǎng)中心適應(yīng)性馴養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)動物造模在天津中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，飼養(yǎng)期間集中給以混合家兔飼料喂養(yǎng)，兔舍室溫介于22～26℃，相對濕度為40%～60%，自然晝夜，自由取食及飲水，每天用自來水刷洗兔籠以保持清潔。 2）實(shí)驗(yàn)儀器：低溫高速離心機(jī)，家兔固定器，常規(guī)手術(shù)器械，真空注射器，采血管。3）實(shí)驗(yàn)試劑：PBS緩沖液 博士德；VEGF酶聯(lián)免疫試劑盒 博士德；INOS酶聯(lián)免疫試劑盒 博士德；Histostain-Plus Mouse Primary USA；Histostain-Plus Rabbit Primary USADAB Kit USA。

1.2 分組

1.2.1 分組 家兔適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將20只家兔按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對照組（簡稱空白組）、寒凝血瘀模型組（共4組），其中空白組4只，模型組16只，對每組家兔分別進(jìn)行編號。

1.2.2 動物模型制備 擬采用冰冷刺激的方法復(fù)制寒凝血瘀家兔模型。具體方法如下：對動物分組完畢，將清醒狀態(tài)下的家兔置于兔板上俯臥位固定，后背暴露在外，用寵物剪將20只家兔后背大椎與至陽之間約5 cm×7 cm范圍區(qū)間剃毛，模型組、治療組家兔固定在兔板上，在大椎穴（《國家標(biāo)準(zhǔn)腧穴名稱與定位GB/T12346-2006》）上固定冰袋1 h，連續(xù)10 d，3組進(jìn)行平衡實(shí)驗(yàn)，空白組同法固定，不進(jìn)行任何干預(yù)。

1.2.3 拔罐選穴與方法

1.2.3.1 治療取穴 大椎穴：以常用實(shí)驗(yàn)動物穴位定位圖譜為依據(jù)，并參照《腧穴名稱與定位》（GB/T12346-2006）和中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會編寫的《中國獸醫(yī)針灸學(xué)》，結(jié)合比較解剖學(xué)和骨度分寸法為依據(jù)進(jìn)行動物穴位模擬定位。

1.2.3.2 拔罐方法 造模成功后第2日起，每日同一時間將拔罐組家兔固定在兔板上，采用罐壓為-0.03Mpa分別在家兔后背督脈大椎穴、大椎下依次拔3個罐，時間為10 min，連續(xù)7 d；拔罐14 d組家兔則按上述拔罐方法連續(xù)拔罐14 d；拔罐21 d組家兔按上述方法連續(xù)拔罐21 d?？瞻捉M和模型組動物同法固定，不進(jìn)行拔罐療法治療。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 測量指標(biāo)及測量方法 運(yùn)用免疫組化法檢測寒凝血瘀家兔拔罐局部皮膚生長因子VEGF和炎性因子iNOS含量變化，運(yùn)用抗氧化法檢測寒凝血瘀家兔拔罐局部皮膚超氧化物歧化酶SOD含量變化。

1.3.2 取材 分別于拔罐后7 d、14 d、21 d，從空白組、模型組家兔中隨機(jī)處死2只，同時處死相應(yīng)拔罐組。拔罐組動物取拔罐位置皮膚組織，空白組和模型組取拔罐組動物拔罐位置相對應(yīng)處皮膚組織。1）將切取的皮膚組織浸泡并固定于4%多聚甲醛溶液中24～48 h，行常規(guī)脫水、浸蠟，制備石蠟包埋標(biāo)本，常規(guī)切片進(jìn)行免疫組化染色，光鏡半定量觀察VEGF和iNOS表達(dá)情況。2）取皮膚組織放入Eppendorf管中，迅速投入液氮中保存，待測皮膚組織中VEGF和iNOS表達(dá)情況。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 運(yùn)用酶標(biāo)儀和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中VEGF和iNOS的含量。

2.2 在光學(xué)顯微鏡下閱片結(jié)合主觀認(rèn)識判斷樣本中VEGF、EGF、iNOS陽性染色的目標(biāo)及強(qiáng)弱。

2.3 采用羥胺法測定和計(jì)算SOD的含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 拔罐干預(yù)后家兔皮膚酶聯(lián)免疫分析結(jié)果 拔罐干預(yù)后，分別取各組家兔對應(yīng)處皮膚，檢測皮膚VEGF和iNOS含量，見表1。

表1 拔罐干預(yù)寒凝血瘀型家兔皮膚組織VEGF和iNOS含量變化（ ，n = 4） ng/L

表1 拔罐干預(yù)寒凝血瘀型家兔皮膚組織VEGF和iNOS含量變化（ ，n = 4） ng/L

注：與空白組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△ P＜0.05

分組 VEGF/（ng/L） iNOS/（U/L）空白組 68.85±1.57 4.10±0.38模型組 58.85±5.68# 4.32±0.15#拔罐7 d組 81.43±6.78△ 4.16±0.11拔罐14 d組 64.02±1.57△ 4.08±0.31拔罐21 d組 59.23±6.58△ 4.12±0.23

3.2 拔罐干預(yù)后寒凝血瘀型家兔局部皮膚免疫組化切片結(jié)果 1）拔罐干預(yù)后寒凝血瘀型家兔大椎穴拔罐處免疫切片后VEGF含量呈陽性表現(xiàn)，褐色細(xì)胞漿處為陽性表現(xiàn)部位。由圖1（插頁二）可見，VEGF在造模后陽性表達(dá)減弱，拔罐7 d后陽性表達(dá)增強(qiáng)，拔罐14 d后陽性表達(dá)有所減弱，拔罐21 d后陽性表達(dá)又有所增強(qiáng)。2）拔罐干預(yù)后寒凝血瘀型家兔大椎穴拔罐處免疫切片后EGF含量呈陽性表現(xiàn)，褐色細(xì)胞漿處為陽性表現(xiàn)部位。由圖2（插頁二）可見EGF陽性表達(dá)在造模后減弱，拔罐7 d后陽性表達(dá)增強(qiáng)，拔罐14 d后陽性表達(dá)持續(xù)增強(qiáng)，拔罐21 d陽性表達(dá)更加明顯。

3.3 拔罐干預(yù)后寒凝血瘀型家兔大椎穴拔罐處免疫切片后iNOS含量呈陽性表現(xiàn)，褐色細(xì)胞漿處為陽性表現(xiàn)部位。由圖3（插頁二）可見，iNOS陽性表達(dá)造模后增強(qiáng)，拔罐7 d后減弱，拔罐14 d后持續(xù)減弱，拔罐21 d后陽性表達(dá)更加減弱。

3.4 家兔皮膚抗氧化測定超氧化物歧化酶SOD結(jié)果拔罐干預(yù)后，分別取各組家兔對應(yīng)處皮膚，檢測皮膚中超氧化物歧化酶含量，見表2。

表2 家兔皮膚組織SOD含量變化（ ，n = 4）mg/mL

表2 家兔皮膚組織SOD含量變化（ ，n = 4）mg/mL

注：與空白組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△ P＜0.05

分 組 SOD空白組 0.24±0.02模型組 0.21±0.02#拔罐7天組 0.24±0.01△拔罐14天組 0.24±0.01△拔罐21天組 0.27±0.02△

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，造?？墒辜彝玫木植科つw中VEGF的含量減低，經(jīng)過一定周期的拔罐療法治療，可使VEGF的含量回升，但是隨拔罐時間的延長，VEGF含量又有所下降。由此可見，不同拔罐時間干預(yù)治療可以使VEGF含量升高，誘導(dǎo)血管生成，但是隨干預(yù)時間和強(qiáng)度的加強(qiáng)，其含量又被調(diào)控至稍高于原始水平。由此推斷，拔罐作用可以通過改變VEGF含量誘導(dǎo)血管生成和增強(qiáng)血管通透性。

造?？墒辜彝卯a(chǎn)生炎癥反應(yīng)，局部皮膚組織中的iNOS含量升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過不同拔罐時間干預(yù)治療可以使iNOS含量減低，但未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有待進(jìn)一步研究。

實(shí)驗(yàn)中的寒凝血瘀家兔皮膚組織中SOD的含量較空白組降低并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不同拔罐時間干預(yù)治療后SOD含量又上升并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此推斷拔罐療法可能具有清除自由基的作用，但含量變化與拔罐時間無明顯相關(guān)性。

5 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，人體是一個有機(jī)的整體，五臟六腑、四肢百骸各個部位都不是孤立存在的，而是內(nèi)外相通、表里相應(yīng)、彼此協(xié)調(diào)、相互為用的整體。拔罐作用于體表皮膚，通過臟腑、經(jīng)絡(luò)、氣血等的整體作用從而起到調(diào)整某些臟腑的功能及扶正祛邪、平衡陰陽的功效。楊金生等[6]把拔罐的功能總結(jié)為以下方面：抵抗外邪，保衛(wèi)機(jī)體；活血化瘀，疏通經(jīng)絡(luò)；調(diào)整氣血，平衡陰陽；反映病候，協(xié)助診斷。王富春等[7]提出拔罐療法在機(jī)體自我調(diào)整中產(chǎn)生行氣活血、舒筋通絡(luò)、消腫止痛、祛風(fēng)除濕等功效，起到一種良性刺激，促使機(jī)體恢復(fù)正常功能的作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)目前對于拔罐療法機(jī)制的探討主要是圍繞其對免疫系統(tǒng)的影響而展開論述的。對于拔罐機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究多集中于負(fù)壓作用對罐斑的影響[8-10]，拔罐局部血流量[11-12]、氧分壓變化[13]及其對免疫功能影響[14-15]等方面。

本實(shí)驗(yàn)中選取的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），是一種對血管生成有極強(qiáng)誘導(dǎo)作用的多功能誘導(dǎo)因子，能特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖、細(xì)胞質(zhì)鈣聚集以及誘導(dǎo)血管生成和使血管通透性增強(qiáng)等作用[16-17]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，寒凝血瘀模型可使家兔的VEGF的含量減低，經(jīng)過一定周期的拔罐療法治療，可使VEGF的含量回升，但是隨拔罐時間的延長，VEGF含量又有所下降，并介于空白組和模型組之間。由此可見拔罐療法可以使血管內(nèi)皮生長因子含量升高，誘導(dǎo)血管生成，但是隨干預(yù)時間和強(qiáng)度的加強(qiáng)，其含量又被調(diào)控至稍高于原始水平。由此推斷，拔罐作用可以通過改變VEGF含量誘導(dǎo)血管生成和增強(qiáng)血管通透性。

表皮生長因子（EGF）是一種多功能的生長因子，在體內(nèi)體外都對多種組織細(xì)胞有強(qiáng)烈的促分裂作用[18]。朱成慧等[19]發(fā)現(xiàn)通過拔罐療法，實(shí)驗(yàn)動物外周血中EGF可有明顯改變。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果亦顯示，家兔局部皮膚中的EGF含量在寒凝血瘀模型建立后，陽性表達(dá)減弱，拔罐干預(yù)后陽性表達(dá)增強(qiáng)，由此推斷拔罐作用可以通過改變EGF含量，促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖。

寒凝血瘀模型可使家兔產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，局部皮膚組織中的iNOS含量升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過拔罐療法干預(yù)可以使iNOS含量減低，其中 iNOS含量隨拔罐干預(yù)、拔罐時間的延長減低程度越明顯。

本實(shí)驗(yàn)中的寒凝血瘀家兔皮膚組織中SOD的含量較空白組降低并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，拔罐治療后SOD含量又上升并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此推斷拔罐療法具有清除自由基的作用。

總之，通過研究寒凝血瘀家兔模型拔罐前后局部皮膚的生長因子、炎性因子的蛋白表達(dá)，證實(shí)拔罐干預(yù)后，拔罐局部皮下血管擴(kuò)張，炎癥反應(yīng)減輕。推斷拔罐療法可能首先對局部皮膚產(chǎn)生良性物理刺激，改善微循環(huán)，通過影響生長、炎性因子等表達(dá)產(chǎn)生持續(xù)弱刺激，形成級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而影響整體微循環(huán)，產(chǎn)生拔罐療法的“通絡(luò)”效應(yīng)。

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