基因FOXP2與高功能孤獨(dú)癥兒童的病例對照研究

張文茂+彭贊平+鄔洪梁

[摘要] 目的 探討FOXP2基因的2個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNPs）位點(diǎn)rs121908377、rs121908378與高功能孤獨(dú)癥兒童之間的相關(guān)性。 方法 方便選取2016年1月—2017年1月在該院兒童保健科確診的100例高功能孤獨(dú)癥兒童（病例組）及同期在兒童保健科體檢中心體檢的120名身體及精神均健康兒童（對照組），應(yīng)用基因芯片及PCR-測序方法對病例組及對照組的rs121908377、rs121908378 位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，對所獲分型數(shù)據(jù)進(jìn)行病例對照關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果 從病例組中隨機(jī)選取的高功能孤獨(dú)癥兒童的基因芯片結(jié)果為陰性，病例組FOXP2基因的2個(gè)SNPs 的基因型頻率為0.960、0.970，對照組的2個(gè)SNPs基因頻率為0.958、0.958，分布均未偏離哈德溫伯格平衡（P>0.05）；FOXP2基因的rs121908377、rs121908378位點(diǎn)的基因型頻率在病例與對照間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 FOXP2基因的rs121908377、rs121908378位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性與高功能兒童孤獨(dú)癥不相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 高功能孤獨(dú)癥；FOXP2基因；PCR-測序法；病例對照研究

[中圖分類號] R5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）10（b）-0001-03

[Abstract] Objective This paper tries to explore the correlation between the rs121908377， rs121908378 SNPs of the FOXP2 gene and the high functioning autism. Methods From January 2016 to January 2017， 100 children with high functioning autism （the case group） and 120 normal children both physically and mentally healthy in the same period （the control group） were convenient selected from this hospital. The rs121908377， rs121908378 SNPs of FOXP2 was genotyped by PCR-Sequencing in individuals with high functioning autism and normal subjects. A correlation study was performed by using the data of genotyping. Results The results of the gene chip of the highly functional autistic children randomly selected from the case group were negative， the frequencies of two SNPs in the genotypes were 0.960 and 0.970 in the case group， 0.958 and 0.958 in the control group， all were in Hardy-Weinberg equilibrium （HWE） （P>0.05）. There were no significant differences in allele frequency of the FOXP2 gene of rs121908377， rs121908378 between the high functioning autisms group and normal control group （P>0.05）. Conclusion The SNPs of rs121908377， rs121908378 of FOXP2 gene were not associated with high functioning autism.

[Key words] High function autism； FOXP2 gene； Polymerase chain reaction-Sequencing； Case-control study

孤獨(dú)癥（autism），又稱自閉癥，是PDD （Pervasive developmental disorder，廣泛性發(fā)育障礙）的代表性疾病，三大特征為刻板行為、語言障礙及社交障礙[1]。ASD一般3歲前發(fā)病并攜帶終生，男性發(fā)病率為女性的4～6倍，我國的兒童孤獨(dú)癥患者約為500萬，已經(jīng)成為危害極其嚴(yán)重的公共健康問題，其中大部分無法被完全治愈，引起社會廣泛關(guān)注[2]。據(jù)家系調(diào)查及孿生子研究，孤獨(dú)癥病因遺傳因素占90%，環(huán)境因素占10%[3]。目前國際上對于孤獨(dú)癥的遺傳學(xué)研究雖然已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，鑒定了超過100多個(gè)易感基因，但由于孤獨(dú)癥高度的表型和遺傳異質(zhì)性，這些位點(diǎn)或基因很少能夠被重復(fù)驗(yàn)證，所有已發(fā)現(xiàn)的遺傳變異還只能解釋大約10%～20%的ASD患者，總體而言，關(guān)于孤獨(dú)癥的分子致病機(jī)制研究還處于早期階段，而且多數(shù)研究以ASD（Autism spectrum disorder，孤獨(dú)癥譜系障礙）而不是典型的孤獨(dú)癥患者為研究對象，進(jìn)一步導(dǎo)致了研究樣本的不同質(zhì)性。基于此，對于孤獨(dú)癥進(jìn)行臨床分型研究是很有必要的一件事情。高功能孤獨(dú)癥是孤獨(dú)癥中總智商（full intelligence quotient， FIQ）≥70的一類特殊人群，占整個(gè)孤獨(dú)癥的30%左右[4]，選取高功能孤獨(dú)癥兒童進(jìn)行研究可以最大限度減少智力相關(guān)因素的影響。FOXP2基因位于染色體7q31，與人的語言表達(dá)能力相關(guān)[5]。最近一項(xiàng)研究探討發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子FOXP2與CNTNAP2基因的表達(dá)調(diào)控相關(guān)，F(xiàn)OXP2轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到CNTNAP2基因內(nèi)含子1的調(diào)控序列上來直接調(diào)控CNTNAP2基因的表達(dá)，使得CNTNAP2基因表達(dá)量大量下調(diào)，進(jìn)而引發(fā)孤獨(dú)癥[6]。該文方便選取2016年1月—2017年1月在該院兒童保健科確診的100例高功能孤獨(dú)癥兒童（病例組）及同期在兒童保健科體檢中心體檢的120名身體及精神均健康兒童（對照組），首次對FOXP2基因及高功能孤獨(dú)癥的關(guān)系進(jìn)行了病例對照研究，為孤獨(dú)癥臨床分型研究提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料

病例組高功能孤獨(dú)癥兒童樣本方便選取于該院兒童保健科，并由1 名獲得兒童精神衛(wèi)生專業(yè)資格證的主任醫(yī)師，按DSM-IV 標(biāo)準(zhǔn)以及國際疾病分類第十版與孤獨(dú)癥相關(guān)的診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷，且其FIQ≥70， 共100例，其中男82例，女18例，平均年齡（7.29±1.92）歲，患者均為漢族兒童，與孤獨(dú)癥類似的脆性X 染色體綜合征、Asperger綜合征、不典型孤獨(dú)癥等疾病均被排除，患兒民族均為漢族。對照組樣本共120名，其中男94名，女26名，平均年齡（8.17±2.23）歲，均為漢族兒童，采集于該院兒童保健科體檢中心，均為身體及精神健康兒童。該研究均征得所有被研究兒童監(jiān)護(hù)人的知情同意，并且與被研究兒童監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。兩組兒童在年齡、疾病組成方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 抽取被試兒童2 mL靜脈血，EDTA抗凝，采用QIAGEN公司的人全血DNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書提取DNA，-80℃保存待測。

1.2.2 基因芯片 隨機(jī)選取其中1例高孤獨(dú)癥兒童的DNA送“北京貝康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所”進(jìn)行基因芯片分析。

1.2.3 生物信息學(xué) 采用SNPbrowser程序和NCBI中SNP數(shù)據(jù)庫選擇FOXP2基因的2個(gè)SNP位點(diǎn)rs121908377、rs121908378，并采用聚合酶鏈反應(yīng)和基因測序的方法對各位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。

1.2.4 PCR及測序（分型檢測） 采用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增FOXP2基因的rs121908377、rs121908378位點(diǎn)序列，使用的引物見表1，PCR產(chǎn)物純化后送英駿公司測序。PCR條件：采用表一所列的正向及反向引物、50μL反應(yīng)體系以及下列所述條件對兩段目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。50 μL反應(yīng)體系中含25 μL酶混合液（1.25 U Takara Taq DNA聚合酶，0.4 mM dNTP，3 mM Mg2+），0.5 μmol/L的引物和100 ng基因組DNA，補(bǔ)加純水至50 μL。rs121908377和rs121908378的PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共32個(gè)循壞，產(chǎn)物純化后-20℃保存。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用haploview 4.1分析軟件對FOXP2基因的rs121908377、rs121908378兩個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因分型數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因芯片

基因芯片結(jié)果為陰性，沒有發(fā)現(xiàn)任何SNPs位點(diǎn)及CNV（copy number varients，拷貝數(shù)變異）。

2.2 哈德溫伯格遺傳平衡檢驗(yàn)

對高功能孤獨(dú)癥病例組和對照組的FOXP2基因的2個(gè)病源相關(guān)的SNP位點(diǎn)rs121908377、rs121908378的基因分型結(jié)果運(yùn)用haploview 4.1軟件進(jìn)行哈德溫伯格遺傳平衡檢驗(yàn)，病例組FOXP2基因的2個(gè)SNPs 的基因型頻率為0.960、0.970，對照組的2個(gè)SNPs基因頻率為0.958、0.958，哈德溫伯格值均為1.0，顯示這兩個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率分布遵守哈德溫伯格平衡（P>0.05）。

2.3 FOXP2基因的連鎖不平衡檢驗(yàn)

基因FOXP2的2個(gè)SNPs配對的D'和r2值見下表2。在病例及對照中，rs121908377和rs121908378兩個(gè)位點(diǎn)之間的連鎖不平衡程度都很低，這與兩個(gè)位點(diǎn)在染色體上相距較遠(yuǎn)相關(guān)。

2.4 FOXP2基因2個(gè)SNPs 的關(guān)聯(lián)分析

高功能孤獨(dú)癥兒童的病例及對照關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示兩個(gè)SNPs位點(diǎn)等位基因在病例及對照間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

3 討論

高功能孤獨(dú)癥是孤獨(dú)癥中的一種臨床分型，高功能孤獨(dú)癥兒童智力水平低于正常兒童，往往伴隨有特殊功能，存在語言感知功能障礙[7]。基因芯片是研究兒童自閉癥最常見的方法[8]，該研究首先是運(yùn)用基因芯片的方法對隨機(jī)選取的1例高功能孤獨(dú)癥兒童進(jìn)行基因分析，結(jié)果顯示沒有發(fā)現(xiàn)SNPs位點(diǎn)及CNVs，進(jìn)一步說明了孤獨(dú)癥的高度異質(zhì)性。

基因FOXP2可能在語言發(fā)育障礙或孤獨(dú)癥發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮某種主要作用[9-10]，其作用機(jī)制與調(diào)控相關(guān)[11]。基于此，該文進(jìn)行了FOXP2基因和高功能孤獨(dú)癥的病例對照研究。該研究結(jié)果顯示FOXP2基因的rs121908377、 rs121908378兩個(gè) SNPs 位點(diǎn)的等位基因頻率在高功能孤獨(dú)癥兒童病例及對照間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），當(dāng)前的研究結(jié)果并不支持FOXP2基因與高功能孤獨(dú)癥的致病相關(guān)。雖然該研究結(jié)果如此，但是這不能成為FOXP2基因與高功能孤獨(dú)癥無關(guān)的證據(jù)，也有可能是因?yàn)樵撗芯恐惺占牟±皩φ諗?shù)量不夠多，無法檢測到微效基因效應(yīng)。事實(shí)上，導(dǎo)致多基因疾病的原因較多，對其進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究普遍存在重復(fù)性差的問題。

綜上所述，該文的病例對照研究結(jié)果不支持FOXP2基因與高功能孤獨(dú)癥的致病相關(guān)。盡管該研究結(jié)果不支持FOXP2基因與高功能孤獨(dú)癥的致病相關(guān)，但由于該研究所收集的樣本量有局限性，而且只基于病例對照法進(jìn)行研究，因此更大樣本量、更多位點(diǎn)以及基于家系研究方法進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證是有必要的。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 張玉，劉蕓，黃浩宇.孤獨(dú)癥病因?qū)W的研究進(jìn)展[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2017，20（11）： 1392-1397.

[2] 郭輝， 胡正茂， 夏昆. 孤獨(dú)癥的遺傳病因?qū)W研究進(jìn)展及基因型-表型關(guān)聯(lián)研究計(jì)劃[J].生命科學(xué)，2014，26（6）：571-582.endprint

[3] Lyall K， Croen L， Daniels J， et al. The changing epidemiology of autism spectrum disorders[J]. Annual review of public health， 2017， 38： 81-102.

[4] 周萍. 高功能孤獨(dú)癥兒童的智力特征分析[J]. 中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用， 2017， 11（5）： 188-189.

[5] Newbury DF， Bonora E， Lamb JA， et al. FOXP2 is not a major susceptibility gene for autism or specific language impairment[J].The American Journal of Human Genetics， 2002， 70（5）： 1318-1327.

[6] Vernes S.CA functional genetic link between distinct developmental language disorders[J].N Engl J Med，2008，359（22）： 2337-2345.

[7] 楊峰， 周家秀， 肖秀云.高功能孤獨(dú)癥兒童漢語普通話語言感知能力障礙的初步研究[J].中國兒童保健雜志， 2015， 23（12）： 1287-1289.

[8] 楊友，金志娟，王劍，等.兒童孤獨(dú)癥譜系障礙 DLGAP1 基因多態(tài)性研究[J].中國實(shí)用兒科雜志，2016，31（10）：761-764.

[9] 胡純純， 徐秀. 孤獨(dú)癥譜系障礙動(dòng)物模型的研究進(jìn)展[J]. 中國循證兒科雜志， 2015， 10（6）： 463-469.

[10] Chien YL，Wu YY，Chen HI，et al. The central nervous system patterning gene variants associated with clinical symptom severity of autism spectrum disorders[J]. Journal of the Formosan Medical Association，2017，116（10）：755-764.

[11] 劉朝陽，高繪菊，牟志美，等.轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 Fox 的功能及分子機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 昆蟲學(xué)報(bào)，2013，56（3）：312-322.

（收稿日期：2017-07-15）endprint