基因芯片技術在慢性HBV感染者病毒基因分型和耐藥基因檢測中的應用及臨床意義

周冬青+王驥+趙嫻+陳輝

[摘要] 目的 采用基因芯片檢測徐州地區慢性HBV感染者病毒基因分型和耐藥基因，并研究其應用價值及臨床意義。方法 收集徐州市傳染病醫院2015年5月—2017年7月在徐州市傳染病醫院肝炎科就診的34例臨床確診為慢性HBV感染且有抗病毒藥物應用史且治療效果不佳患者的臨床資料和患者的血清樣本，采用基因芯片技術對樣本進行乙肝病毒基因分型和耐藥突變的檢測，將檢測結果結合患者的臨床資料進行分析，判斷其應用價值及意義并指導臨床用藥。結果 34例患者檢出HBV DNA陽性為32例，陰性2例，陽性患者中HBV-C型患者26例，HBV-B 型患者3例，HBV-B合并HBV-C患者3例；LAM+Ldt耐藥4例，為2例C型、1例B型、1例B、C合并型；LAM+Ldt+ADV 3例，均為HBV-C型患者；LAM+Ldt+ETV耐藥患者5例，均為HBV-C型；總計12例耐藥患者中含有rtL180M和rtM204I/V突變有8例，rtA181V/T突變有3例，1例為rtM204I/V+rtT184A/I/L/S/F/G突變，4例除rtL180M和rtM204I/V突變還出現rtS203G/I，還有1例rtL180M和rtS202G/I突變。 結論 采用基因芯片檢測乙型肝炎患者的基因分型和耐藥基因，具有重要的應用價值，對指導臨床抗病毒治療具有十分重要的意義。

[關鍵詞] 基因芯片；乙型肝炎病毒基因型；耐藥基因突變；核苷類似物

[中圖分類號] R440 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）10（b）-0034-04

[Abstract] Objective This paper tries to analyze the application and clinical significance of gene chip technology in detection of viral genotypes and resistances genes in chronic HBV infected patients in Xuzhou area. Methods Clinical data and serum samples of 34 patients with chronic HBV infection and antiviral medication history and poor treatment effect from hepatitis department of Xuzhou infectious diseases hospital from May 2015 to July 2017 were studied， detection of hepatitis B virus genotypes and drug resistance mutations by gene chip technology were carried out， the detection results combined with the clinical data of patients were analyzed， its application value and the significance were determined and the clinical therapy was guilded. Results 32 cases were HBV DNA positive among the 34 patients， 2 cases were negative， 26 cases of patients with type HBV-C ， 3 cases of patients with type HBV-B， 3 cases of patients with type HBV-B and HBV-C. 4 cases of LAM+Ldt resistance， 2 cases of type C， 1 case of type B， 1 case of type B and C. 3 cases of patients with LAM+Ldt+ADV， all of which were HBV-C type. 5 cases of patients with LAM+Ldt+ETV resistance were HBV-C type. A total of 8 cases of drug resistance patients containing rtL180M and rtM204I/V mutation in 12 cases， 3 cases of rtA181V/T mutation， 1 case of rtM204I/V+rtT184A/I/L/S/F/G mutation， 4 cases in rtL180M and rtM204I/V mutations as well as rtS203G/I， and 1 case of rtL180M and rtS202G/I mutation. Conclusion Gene chip for genotyping and drug resistance genes in hepatitis B patients has important application value and is of great significance in guiding clinical anti-virus treatment.

[Key words] Gene chip； Hepatitis B virus genotypes； Drug-resistant gene mutation； Nucleoside analogue

乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性分布，全球約有3.5億感染者。我國屬于感染的高發區，現有的慢性HBV感染者約9 300萬例，每年約有30萬死于與HBV相關的肝臟疾病所致的肝硬化、肝癌等嚴重肝病[1]。根據DNA序列差異，目前，HBV可分為A-J 10種基因型[2-3]，其中，我國以B型和C型為主。不同型別在流行特征，致病性，對藥物治療反應等方面存在差異。針對慢性HBV感染的治療方法主要是抗病毒治療，目前主要有干擾素和核苷（酸）類兩類藥物。由于干擾素需要反復注射，且副作用較多，而核苷（酸）類藥物因其抑制病毒復制能力強、使用方便、耐受性好且療效確切，適用于不同階段的乙肝患者等優點，核苷（酸）類藥物已是抗HBV治療的主要手段[4]，但是，隨著治療時間的延長，往往會出現病毒耐藥株[5-6]，因而需要對病毒耐藥基因進行監測，以指導臨床用藥。目前乙型肝炎病毒基因分型法及耐藥基因檢測方法大多采用基因擴增以后的測序方法完成，一般的醫療單位不具備測序條件，無法進行核酸比對分析，因而不適于基層醫院的推廣應用。乙肝病毒的逆轉錄復制機理使得乙肝病毒變異較為常見。內源性和外源性選擇壓力下很容易產生免疫逃避變異株[7-8]。基因芯片為采用光導原位合成及顯微印刷將大量特定序列探針密集有序的固定于載體上，通過多元雜交進行定性及定量的方法。微型化、集成化、高通量，平行化及敏感性強為其主要特點[9-10]。為此方便收集徐州市傳染病醫院2015年5月—2017年7月在徐州市傳染病醫院肝炎科就診的34例臨床確診為慢性HBV感染且有抗病毒藥物應用史且治療效果不佳患者的臨床資料和患者的血清樣本，采用基因芯片技術對樣本進行乙肝病毒基因分型和耐藥突變的檢測，將檢測結果結合患者的臨床資料進行分析，判斷其應用價值及意義并指導臨床用藥，現報道如下。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便收集34例徐州市傳染病醫院收治的乙型肝炎患者血液標本及臨床資料，所有患者均服用過核苷類似物或正在服用核苷類似物進行抗病毒治療；其中男性25例，女性9例；年齡31～87歲，平均44.33歲，所有患者均根據2015年《中國慢性乙肝防治指南》診斷標準[11]具有明確診斷，初次應用抗病毒藥物患者除外，HBV DNA含量均大于103。患者清晨空腹采取血液3～5 mL，待測樣本離心后取血清存放與-20℃冰箱。

1.2 主要儀器和試劑

儀器：核酸提取儀、熒光定量PCR儀、分子雜交儀、冰箱。試劑：核酸提取試劑盒、HBV DNA 熒光定量檢測試劑盒（福建廈門安普利生物有限公司，下限為103IU/mL）、乙肝病毒基因分型及耐藥檢測基因芯片。

1.3 方法

26例患者的血清標本均采用熒光定量PCR和基因芯片2種方法進行檢測，將2種方法檢測的結果結合患者的臨床資料與其他實驗室檢查（肝功能、血清免疫標志物、肝纖維檢測等）結果綜合分析，判斷其應用價值，以便根據檢測結果更合理地為患者用藥。核酸提取及熒光定量PCR檢測方法嚴格按照說明書進行操作。基因芯片技術檢測乙肝病毒基因分型及耐藥基因亦嚴格按照說明書進行操作，并根據實際實驗室條件，進行優化操作方法，保證檢測結果可信，具體包括以下操作步驟：①DNA提取：取20 μL蛋白酶K加入編號的1.5 mL離心管中，然后加入200 μL血清和200 μL裂解液，上下顛倒混勻；置56℃恒溫水浴中10 min后加入300 μL無水乙醇并混勻，緩慢轉移上述液體至離心柱中央，12 000 rpm離心1 min，棄濾液加入700 μL洗液Ⅰ（用前加入無水乙醇），洗滌后棄濾液，加入700 μL無水乙醇，棄濾液，干燥，洗脫，保存備用。②PCR擴增：取出含PCR擴增反應液的PCR管，編號后離心5 s，加入待測樣本1.5 μL，5 000 rpm離心2 s，放入PCR儀擴增，PCR程序設置：50℃ 2 min，95℃10 min；94℃ 60 s+68℃ 90 s 30個循環；94℃ 30 s+54℃ 30 s+72℃ 30 s 30個循環；72℃ 5 min，12℃保存。③雜交、結果判讀：膜條、6 mL的A液和對應的PCR產物加入離心管，沸水浴10 min變性，取出離心管放入雜交箱進行雜交，將膜條放入B液洗滌，放入孵育液室溫孵育，膜條放入A液搖洗2次，放入C液洗滌1次，現配顯色液，避光顯色；純凈水或去離子水洗滌至少1次，判讀結果，4℃保存膜條。④結果判讀：rt180M和rt204I/V、rt204I/V、rt181V/T、rt207I位點突變為拉米夫定（LAM）耐藥，rt180M和rt204I/V、rt204I/V、rt181V/T位點突變為替比夫定（Ldt）耐藥，rt181V/T和rt236T突變為阿德福韋酯（ADV）耐藥，rt180M和rt204I/V、rt204I/V以及rt184I/S/A/F/L/G、rt250I/L/V、rt202G/I位點突變為恩替卡韋（ETV）耐藥。

2 結果

34例患者檢出HBV DNA陽性為32例，陰性2例，陽性率94.11%，與熒光定量PCR檢測結果基本一致。

32例陽性患者中HBV-C型患者26例，HBV-B 型患者3例，HBV-B合并HBV-C患者3例，HBV-B 型患者3例，HBV-B合并HBV-C患者3例與。說明徐州地區患者主要。

34例患者檢出12例耐藥患者，耐藥檢出率35.2%，其中LAM+Ldt耐藥4例，為2例C型、1例B型、1例B、C合并型；LAM+Ldt+ADV耐藥3例，均為HBV-C型患者；LAM+Ldt+ETV耐藥患者5例均為C型。

12例出現基因突變的耐藥患者中rtL180M和rtM204I/V突變有8例，rtA181V/T突變有3例，1例為rtM204I/V+rtT184A/I/L/S/F/G突變，4例除rtL180M和rtM204I/V突變還出現rtS203G/I，還有1例rtL180M和rtS202G/I突變。這12例耐藥突變患者曾長期使用核苷類似物進行抗病毒治療，起初效果較好，肝功能較快恢復正常，HBV-DNA下降速度較快，患者用藥48周后出現肝功能異常，HBV-DNA大于104，甚至高達106，ALT反復異常，患者病情出現了反跳，因此檢測結果與臨床基本一致。

采用基因芯片檢測乙型肝炎患者的基因分型和耐藥基因，具有重要的應用價值，對指導臨床抗病毒治療具有十分重要的意義。

3 討論

目前乙型肝炎病毒耐藥變異的檢測與分析主要有以下幾種方法：①PCR產物直接測序法：該技術一次可準確測序HBV逆轉錄酶A-E區的全長549bp，通過一次實驗能檢測全部已知和可能的耐藥變異位點。但是該法靈敏度較差，只有當變異株超過20%時才能被發現。②聚合酶聯反應-限制性片段長度多態性：該方法敏感性較強，可檢測數量為5%耐藥變異株，然而只能檢測單位點變異，隨著多種核苷類似物的應用和HBV變異位點的不斷出現，該方法難以滿足臨床要求。③反向雜交法：該法敏感性較強，可檢測占HBV準種池5%～10%的耐藥變異樣品，信息量大，自動化高。但儀器、試劑昂貴，操作復雜，因此難以用于臨床。④實時PCR方法：該法可檢測變異率大于10%的耐藥變異，但僅能檢測單位點變異。⑤基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜：該技術是近年來發展的一種軟電離新型質譜，已成為檢測鑒定多糖、蛋白質、核酸、糖蛋白等有力工具，具有靈敏性高、準確、分辨率高特點，可發現數量不足1%HBV變異株，但設備昂貴、難以應用于臨床。基因芯片是一種新型檢測技術，與上述其他各種方法比較，不但具有快速、高效、敏感、平行化、自動化等優點，而且不需要昂貴的測序儀、激光解吸電離時間質譜儀等儀器，操作簡單，結果判斷直觀可見。endprint

研究結果發現12例出現基因突變的耐藥患者中rtL180M和rtM204I/V突變有8例，rtA181V/T突變有3例，1例為rtM204I/V+rtT184A/I/L/S/F/G突變，4例除rtL180M和rtM204I/V突變還出現rtS203G/I，還有1例rtL180M和rtS202G/I突變。說明rtL180M和rtM204I/V是最常見的基因突變位點，而且rtL180M位點突變常合并rtM204I/V基因位點突變。劉健等[12]在《拉米夫定和阿德福韋酯抗病毒療效與HBV 基因型關系》一文中對乙肝病毒耐藥基因位點檢測結果認為， 拉米夫定組耐藥基因位點主要為rtL180M，其次為rtM204I/V； 阿德福韋酯組耐藥基因位點為rt236T，其次為rt181V/T；這與該次的研究結果不盡相同，該次研究結果發現多數患者出現兩個位點以上同時突變，由于隨著抗病毒藥物應用種類增多和應用范圍擴大，乙型肝炎病毒會出現耐多藥基因，這對于臨床如何選擇更合適抗病毒治療方案是一種嶄新的挑戰。

研究中發現12例患者均對LAM和Ldt耐藥，3例合并ADV耐藥，5例合并ETV耐藥，這可能LAM應用最早（1998年美國FDA第一個批準的抗乙肝病毒藥物）且應用最廣泛有關（價格相對較低），鑒于LAM耐藥率較高的原因（經過連續5年的治療， 約70%的患者會出現耐藥[13]）， 替比夫定也被作為一種常用的抗病毒藥物，一旦患者出現LAM耐藥，對Ldt也會耐藥，如果使用Ldt治療將無效；對于LAM耐藥患者常聯合ADV用于抗病毒藥物治療以提高抗病毒藥物療效，因此使部分聯合用藥患者在LAM耐藥基礎上出現了LAM與ADV同時耐藥，近年來有學者認為恩替卡韋能夠強效抑制乙肝病毒，且耐藥率低[14]，該次研究發現12例耐藥患者中有5例出現了ETV耐藥，說明隨著ETV的推廣應用，ETV耐藥率正在增加；因此急需研究新的耐藥率極低的抗病毒藥物以便更好地抑制乙型肝炎病毒。

研究發現32例陽性患者中HBV-C型患者26例，其中突變的患者中有2例為B型，其余均為C型，由于C型基因患者多于B型基因患者，因此C患者基因耐藥突變率多于B型基因患者并不能說明C型基因容易突變，由于樣本例數太少，尚無法進行統計學分析，需擴大樣本進一步研究。

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（收稿日期：2017-08-18）endprint