細梗香草的抗腫瘤作用研究進展

許雅思, 丁藝暉, 高 佳, 張仕蓉

(1. 浙江大學醫學院附屬杭州市第一人民醫院轉化醫學研究中心，浙江 杭州 310006；2. 浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 310006；3. 杭州市第一人民醫院心臟外科，浙江 杭州 310006；4. 南京醫科大學附屬杭州醫院胃腸外科，浙江 杭州 310006)

細梗香草(LysimachiacapillipesHemsl，L.capillipes)，又名香排草、香草、毛柄珍珠菜，載于《中國植物志》《浙江省植物志》《廣西植物名錄》等,系報春花科(Primulaceae)珍珠菜屬植物，主要分布于我國華南、西南地區。民間主要用于治療感冒咳喘、風濕痛、神經衰弱、月經不調、虛弱等。該植物的藥理活性主要體現在清熱解毒、抗腫瘤、增強免疫功能等方面。其化學成分主要包含：皂苷類，以細梗香草皂苷B(Lysimachia capilliposide B，LC-B)和C(Lysimachia capilliposide C，LC-C)這兩個化合物為主，其含量占總皂苷的70%以上[1]；黃酮類，從L.capillipes中分離出的黃酮類化合物，包括黃酮和黃酮醇類以及它們的苷[2-3]；甾醇類化合物，從L.capillipes中分離出8個化合物，其中化合物Ⅰ的結構為全順式-5-脫氧戊糖酸-γ-內酯[3-4]；揮發性成分，L.capillipes的揮發性成分主要為有機酸類(不同鏈長的飽和酸、不飽和酸，以及芳香酸、二羧酸等)和揮發油(六氫金合歡烯酰丙酮、苯乙醇、香葉基丙酮等)[5]。

傳統的化療藥物在治療惡性腫瘤的過程中帶來的生存獲益有限，且存在一定的毒副反應。祖國傳統的中草藥在腫瘤治療中具有增效減毒的獨特優勢，比如皂苷類，具有抗炎、抗腫瘤等活性，其通過很多生物學過程，包括細胞凋亡、基因轉錄、血管生成、腫瘤轉移等發揮作用[6-8]。LC-B和LC-C為L.capillipes中主要的皂苷類成分。近幾年研究發現，L.capillipes可以有效抑制多種癌細胞的增殖，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、鼻咽癌、胃癌、卵巢癌等。鑒于L.capillipes對腫瘤的作用機制復雜，現對該植物的抗腫瘤藥理活性綜述如下。

1 抗腫瘤作用機制

研究表明，LC-B對人卵巢癌A-2780細胞具有明顯的細胞毒作用(IC50為0.1 mg·L-1)[9]。LC-C抑制人肺癌A549和乳腺癌MCF7細胞的生長，IC50分別為 0.433 4 μmol·L-1和0.607 4 μmol·L-1[10]。Li等[11]發現，LC-C可以劑量和時間依賴性抑制人前列腺癌細胞PC-3(IC50為5.33 μmol·L-1)和 DU145(IC50為9.99 μmol·L-1)生長，并抑制其細胞集落形成。本課題組前期研究也發現，不同濃度細梗香草總皂苷(Lysimachia capilliposide，LC)對H460 肺癌細胞的增殖均有明顯抑制作用，且呈劑量依賴性[12]。體內藥理學研究發現，LC可劑量依賴性地抑制多種腫瘤細胞荷瘤裸鼠腫瘤的生長，在前列腺癌、胃癌及卵巢癌中的抑瘤率分別為58.7%、56.2%、55.7%[13]。

1.1誘導細胞凋亡Li等[11]發現LC-C能夠誘導人前列腺癌細胞PC-3凋亡，同時降低線粒體膜電位水平；并激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)和絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途徑,下調Bcl-2、JNK、p38 α/β，上調Bax、p-JNK、p-p38。花永虹等[14]發現，LC對鼻咽癌CNE-2 細胞株有誘導凋亡的作用，其凋亡率達16.4%；作者通過構建p53上調凋亡調節因子(p53 upregulated modulator of apoptosis, PUMA)干擾載體(PUMA-siRNA)，發現L.capillipes誘導凋亡與上調PUMA-Bax途徑有關[15]。我們也發現，LC作用后的H460細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率分別是19.8%和28.9%[12]。活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)被認為在腫瘤的發生、發展以及維持過程中扮演著多種角色[16]。細胞中ROS的激增導致了細胞周期的阻滯，同時也引發了細胞凋亡[17]。在研究LC對非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)影響的實驗中[18]，高濃度LC作用的H460細胞中含有更高水平的ROS，還可使H460細胞IκB、Bax和caspase-3表達增加，而使NF-κB和Bcl-2 表達降低。Li等[11]應用DCFH-DA熒光探針檢測不同濃度LC-C作用下的前列腺癌PC-3細胞株中的ROS水平，結果表明LC-C能增加ROS水平。結合LC劑量依賴性地促使細胞凋亡，這些數據表明L.capillipes能夠增加ROS水平，抑制NF-κB通路，促進下游促凋亡蛋白Bax的表達，抑制Bcl-2蛋白表達，激活caspase-3酶來執行凋亡命令，最終激活了線粒體凋亡途徑[19]。

1.2腫瘤細胞周期阻滯費正華等[12]利用流式細胞術分析LC作用后的H460細胞周期情況，結果表明LC劑量依賴性地促使H460細胞被阻滯在S期，相比于對照組S期12.4%的阻滯率，不同濃度LC(2、4、6 mg·L-1)作用下的H460細胞的S期阻滯率分別是22.7%、34.8%、44.0%。細胞內存在一系列監控機制，確保細胞周期各時相轉化有序進行，細胞凋亡和細胞周期的進程是密切相關的，當DNA受損或復制不完全時，細胞周期將停留于某一時相，待DNA修復或復制完全后，方可進入下一時相，若DNA不能修復或不能完全復制，則啟動凋亡機制，引起細胞凋亡。由于S期細胞群的增加，伴隨著的是G0/G1期和G2/M期細胞群的減少，H460細胞大量在S期堆積，阻止了向G2/M期的轉變，減緩癌細胞有絲分裂過程，從而導致腫瘤細胞快速凋亡。

1.3抗腫瘤血管生成腫瘤血管的形成對直徑大于3 mm的實體瘤的進一步生長極其重要，腫瘤誘導新生血管形成的過程是一個多種正、負因素共同作用的結果。有研究表明，三萜皂苷可能通過受體酪氨酸激酶以及VEGF/VEGFR信號通路，抑制血管增生[20]。徐燕等[13]研究胃癌BGC-823裸鼠腫瘤組織免疫組化結果顯示，L.capillipes高劑量組VEGF表達與模型組相比明顯減少，提示L.capillipes可能通過抑制VEGF的表達，從而抑制腫瘤生長。

1.4增強免疫活性通過建立人源腫瘤裸鼠的移植模型，檢測脾T淋巴細胞增殖情況和IL-2活性，發現LC可以促進淋巴細胞對有絲分裂原的反應性，增強T淋巴細胞功能，從而促進T細胞介導的細胞免疫反應[13]。

2 聯合抗腫瘤作用

晚期腫瘤治療的最大難題是復發轉移和耐藥。目前治療上多采用包括化療、靶向、放療及外科在內的綜合治療，中藥聯合這些治療手段成為目前研究的重點和熱點。

2.1聯合靶向及化療表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)突變基因的發現和受體酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)的發展，給NSCLC患者帶來了新的曙光。然而,第一代TKIs (吉非替尼和厄洛替尼)的有效期僅為10～16個月，大約50%的耐藥患者是因為出現了繼發或原發性T790M基因突變。Zhang等[21]探索了LC合用吉非替尼對于NSCLC的效果，結果顯示LC不僅協同提高了吉非替尼抑瘤能力，而且恢復了耐藥細胞對于吉非替尼的敏感性。LC合用明顯增加了吉非替尼對其耐藥細胞PC-9-GR(EGFR T790M突變)的抑制水平，IC50值從(6.80 ± 1.00)μmol·L-1降到(0.77 ± 0.12)μmol·L-1。進一步探索機制發現，LC合用吉非替尼明顯降低了EGFR下游信號通路Akt蛋白水平，而兩藥單用對Akt均無明顯影響。體內動物實驗表明，接種PC-9-GR細胞的移植瘤小鼠模型中，LC和吉非替尼合用明顯抑制了腫瘤細胞的增殖。此外，我們的前期數據顯示，LC可能通過表觀遺傳修飾，逆轉人卵巢癌紫杉醇耐藥細胞的化療敏感性。

2.2聯合放療放射治療作為腫瘤綜合治療的重要組成部分，在腫瘤治療各階段發揮了重要作用。細胞主要通過兩種主要的途徑來完成修復放療導致的DNA損傷，分別是同源重組(homologous recombination，HR)和非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)。HR以姐妹染色單體為模板，對DNA雙鏈斷裂進行的高保真修復，其主要作用于細胞周期的S期和G2期[22]。NHEJ相較HR是一種非高保真修復方式，其可在所有細胞周期上發生，但主要在細胞周期的G1期和M期[23]。LC單用或合用化療顯示出了良好的抗腫瘤作用，但與放療聯合的研究尚缺乏。課題組前期研究發現，LC聯合放療作用于H460和H1299的放療增敏比分別為1.67和2.07，顯示出良好的放療增敏作用[24]。進一步研究顯示，LC聯合放療和單純放療組作用于H460細胞，凋亡率分別為30.5%和15.2%，作用于PC-9細胞，兩組凋亡率分別為30.6%和14.6%，提示LC可以明顯提高放療對肺癌細胞的促凋亡作用。Western blot顯示，LC聯合放療增加促凋亡蛋白Bax表達，抑制抑凋亡蛋白Bcl-2。作者構建3種報告基因的骨髓瘤細胞282細胞(NHEJ)、280細胞(HR)、283細胞(SSA)，LC作用后，282細胞比例減少了34%，280細胞未見明顯改變，而283細胞輕度升高，提示LC對NHEJ修復具有明顯抑制作用。然后對NHEJ通路相關蛋白進行檢測發現，DNA-PKcs、RAD50、Ku70/Ku80明顯下降。敲除DNA-PKcs后，LC放療增敏作用大大減弱，這印證了LC具有良好的放療增敏作用，并且這一放療增敏作用是與NHEJ途徑有關。

3 小結

L.capillipes具有明顯的抗腫瘤作用，其抗腫瘤的主要機制包括促進細胞凋亡、細胞周期阻滯、抗血管生成等，合用靶向、化療以及放療表明L.capillipes有很好的開發前景。L.capillipes相關的臨床和藥理研究報道并不多，作為藥效廣泛和資源豐富的民間藥用植物，有必要深入研究該植物的藥理作用機制，為充分發揮其抗腫瘤作用提供科學依據。