二氫楊梅素對高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠體內(nèi)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運的影響

朱景平，衛(wèi)欣妤，許曉樂

(1. 南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院臨床藥學(xué)科，河南 南陽 473000；2. 南通大學(xué)藥學(xué)院藥理系,江蘇 南通 226001)

膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(reverse cholesterol transport，RCT) 通過促進膽固醇排泄，能明顯降低血漿中膽固醇水平，減少膽固醇在血管壁聚積，從而有效防止動脈粥樣硬化相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展。RCT包含膽汁途徑和非膽汁途徑兩種。膽汁途徑 RCT使巨噬細胞內(nèi)及外周組織的膽固醇通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)運到肝臟，轉(zhuǎn)化為膽汁酸排出體外。非膽汁途徑RCT則主要是脂蛋白將巨噬細胞及外周組織內(nèi)膽固醇運輸?shù)叫∧c，經(jīng)小腸分泌到腸腔后排出體外的過程[1-2]。二氫楊梅素(dihydromyricetin，DMY) 是一種黃酮類化合物，存在于多種植物中，其中藤茶類植物中含量較大。DMY已被證實具有抗炎、抗氧化、解酒保肝、抗菌、抗癌、抗糖尿病等多種藥理作用[3]。此外，DMY改善高脂飲食動物的血脂，降低血中膽固醇含量已被證實[4-5]。我們近期的實驗表明，DMY明顯抑制低密度脂蛋白受體基因敲除小鼠(low-density lipoprotein receptor knockout mice,LDLr-/-)和載脂蛋白E基因敲除小鼠(apolipoprotein E knockout mice,ApoE-/-)動脈粥樣硬化斑塊的形成，改善動脈粥樣硬化小鼠血脂水平[6-7]。但DMY抗動脈粥樣硬化的機制還未完全闡明。鑒于RCT在血中膽固醇平衡中的重要作用，本研究旨在高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠模型上，觀察DMY對小鼠體內(nèi)RCT的影響及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物 6周齡♂C57BL/6J背景的ApoE-/-小鼠和野生型(wild-type，WT) C57BL/6J小鼠，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部(實驗動物科學(xué)部)，許可證號：SCXK(京) 2011-2012。

1.1.2 藥物與試劑 DMY購自西安天豐生物科技有限公司，批號NF-20151110；高脂飼料含脂肪21%、膽固醇0.21% (型號D12079B)，購自常州開源飼料有限公司；Amplex Red細胞膽固醇檢測試劑盒，購自Invitrogen公司；油紅O染色試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；總膽固醇(total cholesterol, TC)和甘油三酯(triglyceride, TG)測試試劑盒，購自中生北控生物科技有限公司；三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)動體(ATP binding cassette transporter, ABC)A1小鼠單克隆抗體、ABCG1兔單克隆抗體、ABCG5兔多克隆抗體、ABCG8兔多克隆抗體、膽固醇7α-羥化酶(cholesterol 7-alpha hydroxylase,CYP7A1)兔多克隆抗體，均購于美國Abcam公司；GAPDH小鼠單克隆抗體，購自上海康成生物有限公司；總RNA 提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；SYBR Green熒光定量試劑盒購自TaKaRa公司；胎牛血清購自Hyclone公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器 冰凍切片機(美國Beckman Coulter公司)；ABI 7500熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystem公司)；全套Bio-Rad電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；Olympus DP72顯微鏡(日本Olympus公司)；全功能微孔板檢測儀(美國Bio-Tek公司)。

1.2方法

1.2.1 動物模型的建立 ApoE-/-小鼠分成3組：模型組，給予高脂飲食8周；DMY低、高劑量組，ApoE-/-小鼠高脂飲食同時，給予DMY 250、500 mg·kg-1；與ApoE-/-小鼠相同背景的WT C57BL/6J小鼠作為陰性對照組，高脂飲食8周。每組8只小鼠。DMY溶于0.5%羧甲基纖維素鈉中，灌胃給藥。模型組和陰性對照組小鼠高脂飲食同時，灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉。

1.2.2 實驗取材 造模結(jié)束前，實驗動物禁食12 h，給予充足的水。取材前，小鼠稱重。腹腔注入5 mL預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)，抽取腹腔滲出液，4 ℃下1 500 r·min-1離心5 min。細胞重懸于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中備用。打開小鼠胸腔暴露心臟，剪破右心耳，以小號頭皮針從心尖位置插入，灌注預(yù)冷生理鹽水5 min，直至血水變清，肝臟變白。灌注完畢取出肝臟、小腸，肝臟稱重。將部分肝臟、小腸在生理鹽水中洗滌，液氮速凍后保存?zhèn)溆谩２糠指闻K放入4%的多聚甲醛中固定，待切片染色。

1.2.3 肝臟組織油紅O染色 染色前冰凍切片，4%多聚甲醛固定30 min。染色缸中雙蒸水洗5 min，10%異丙醇浸洗5 min，油紅O工作液染色30 min，60%異丙醇調(diào)色，隨時放入清水中，調(diào)色結(jié)束后立即水洗，雙蒸水洗2遍，蘇木精復(fù)染核2 min，顯微鏡下觀察。流水沖洗約1 min。放入1%鹽酸乙醇分化5 s。流水沖洗約10 min，直至細胞核呈現(xiàn)深藍色。擦拭干凈組織周邊水分，將切片擦干，甘油明膠封片，拍照。

1.2.4 巨噬細胞油紅O染色及脂滴密度測定 將細胞用4%多聚甲醛固定30 min。PBS洗5 min，10%異丙醇浸洗5 min。用0.5%油紅O染液染色30 min。蘇木精復(fù)染核2 min，放入1%鹽酸乙醇分化5 s。細胞內(nèi)脂質(zhì)呈紅色，細胞核呈藍色，細胞內(nèi)脂質(zhì)含量密度采用在540 nm波長處測定吸光度。

1.2.5 巨噬細胞內(nèi)膽固醇含量測定 細胞接種于6孔板，每孔加入50 μL反應(yīng)液，再加入50 μL工作液，避光，37 ℃孵育30 min；檢測熒光強度，吸收波長530 nm，發(fā)射波長590 nm。細胞蛋白含量采用BCA蛋白定量試劑盒檢測。

1.2.6 肝臟生化指標(biāo)測定 肝臟中TC和TG檢測按照試劑盒說明書進行。

1.2.7 Real time PCR檢測 按試劑盒說明提取RNA，然后通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA，以cDNA作為模板，使用SYBR Green進行定量PCR。PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。以18S RNA為內(nèi)參，引物序列見Tab 1。

Tab 1 Gene and primer for real-time PCR

1.2.8 Western blot檢測 組織液氮研磨后，加入裂解液，置冰上裂解30 min；移入1.5 mL離心管中，12 000 r·min-1、4 ℃離心15 min；將上清吸入離心管中，BCA法蛋白定量。將蛋白樣品配平后加入5×上樣緩沖液，混勻，95 ℃ 5 min滅活，備用。按需要配制凝膠，加樣后，接通電源，80 V電泳至Marker分離，換100 V電泳直至溴酚蘭抵達分離膠底部。用硝酸纖維素膜進行轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)好的膜放入封閉液中，4 ℃封閉過夜。漂洗后，一抗4 ℃孵育過夜。二抗室溫避光孵育2 h。漂洗后，ODYSEEY掃描儀掃膜顯影，并用圖像分析系統(tǒng)進行灰度分析，以GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1DMY對ApoE-/-小鼠腹腔巨噬細胞脂質(zhì)沉積和RCT相關(guān)蛋白表達影響如Fig 1A～1C所示，與WT組相比，ApoE-/-小鼠高脂飲食8周后，腹腔巨噬細胞油紅O染色顯示脂滴明顯增加，細胞內(nèi)膽固醇含量也明顯增加。而DMY低、高劑量組能明顯減少小鼠腹腔巨噬細胞脂質(zhì)的沉積和膽固醇含量。Fig 1D的Western blot結(jié)果顯示，與模型組相比，DMY能增強RCT蛋白ABCA1和ABCG1的蛋白表達。

2.2DMY抑制ApoE-/-小鼠肝臟脂肪變性肝臟組織冰凍切片行油紅O染色的結(jié)果顯示，與WT組相比，ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)8周，油紅O染色面積及顏色深度均增加，表明出現(xiàn)嚴重的脂質(zhì)蓄積。而DMY低、高劑量干預(yù)組與模型組相比，染色面積及顏色深度均下降(Fig 2A)。此外，與WT組相比，模型組ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)后肝臟重量明顯增加，DMY低、高劑量干預(yù)組與模型組相比，肝臟重量有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Fig 2B)。肝臟中TC和TG含量檢測結(jié)果表明，DMY低、高劑量干預(yù)組與模型組相比，均能明顯降低肝臟中TC和TG含量(Fig 2C、2D)。

2.3DMY對ApoE-/-小鼠肝臟RCT相關(guān)蛋白表達的影響Real time PCR檢測小鼠肝臟RCT相關(guān)蛋白mRNA表達結(jié)果顯示(Tab 2)，與模型組相比，DMY低、高劑量組能明顯增加ABCG5、ABCG8、CYP7A1 mRNA表達，對B族I型清道夫受體(scavenger receptor class B type I,SR-BI)、ABCB4、ABCB11 mRNA的表達無明顯影響。Fig 3的Western blot結(jié)果證實，DMY低、高劑量組能明顯增加肝臟ABCG5、ABCG8、CYP7A1的蛋白表達。

Fig 1 Effect of DMY on macrophage foam cell formation in ApoE-/- mice

A:Representative images of Oil Red O staining of mice peritoneal macrophages; B:The density of the lipid content (n=8);C:Cholesterol content in mice peritoneal macrophages(n=8); D:Protein expression of ABCA1 and ABCG1 in peritoneal macrophages(n=4).#P<0.05vsWT group;*P<0.05vsApoE-/-group.

Fig 2 Effects of DMY on hepatic lipid accumulation and steatosis in ApoE-/-

A:Representative images of liver sections stained with Oil Red O; B:Liver weight; C:Liver TC content; D:Liver TG content.#P<0.05vsWT group;*P<0.05vsApoE-/-group.

Tab 2 Effects of DMY on mRNA expression of SR-BI, ABCG5, ABCG8, ABCB4, ABCB11 and CYP7A1 in liver of ApoE-/-

#P<0.05vsWT group;*P<0.05vsApoE-/-group

Fig 3 Effects of DMY on protein expression of ABCG5, ABCG8 and CYP7A1 in liver of ApoE-/-

*P<0.05vsApoE-/-group

2.4DMY對ApoE-/-小鼠小腸RCT相關(guān)蛋白表達的影響Fig 4的Western blot結(jié)果顯示，與模型組相比，DMY低、高劑量組能明顯增加小腸ABCG5和ABCG8的蛋白表達。

Fig 4 Effects of DMY on protein expression of ABCG5 and ABCG8 in intestine of ApoE-/-

*P<0.05vsApoE-/-group

3 討論

調(diào)脂研究近年來得到了新的發(fā)展，與以往單純關(guān)注血脂水平高低的不同，新的調(diào)脂研究深入到分子水平，尤其對細胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)的相關(guān)機制進行了研究，提出了RCT過程[1]。DMY抗動脈粥樣硬化作用和改善血脂作用雖然已被證實，但其機制還未闡明。我們利用體外培養(yǎng)巨噬細胞證實，DMY能促進巨噬細胞膽固醇流出，減輕巨噬細胞脂質(zhì)蓄積[7]。為了全面分析DMY對RCT的影響，本實驗利用高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠，重點觀察DMY對在體RCT的影響及相關(guān)機制。

目前，以C57BL/6小鼠為背景的載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因敲除小鼠被廣泛用于動脈粥樣硬化的研究中[8]。我們已在高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠上觀察到DMY能明顯減少斑塊面積，并明顯降低血中TC、TG和低密度脂蛋白-膽固醇的水平，增加血中高密度脂蛋白-膽固醇水平[7]。巨噬細胞源性的泡沫細胞在動脈粥樣硬化早期脂紋期到后期粥樣斑塊形成期，都發(fā)揮關(guān)鍵作用。侵入血管內(nèi)膜層的巨噬細胞通過表面的清道夫受體，對修飾型低密度脂蛋白進行吞噬，同時也通過細胞上的膽固醇轉(zhuǎn)運體蛋白，將細胞內(nèi)過多的膽固醇排出，當(dāng)細胞內(nèi)膽固醇排出水平低于攝取水平，巨噬細胞將轉(zhuǎn)變?yōu)橹|(zhì)超載的泡沫細胞，這一轉(zhuǎn)變與細胞內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)失衡密切相關(guān)[9]。主動脈斑塊處巨噬細胞通常用腹腔巨噬細胞進行替代[10]。本研究結(jié)果顯示，DMY能明顯減少腹腔巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)和膽固醇含量，提示此作用有助于減少斑塊的形成。進一步研究表明，DMY能明顯增強腹腔巨噬細胞上ABCA1和ABCG1蛋白的表達。ABCA1和ABCG1為膜蛋白，屬于三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體超家族，通過水解ATP供能，實現(xiàn)對膽固醇等底物的跨膜轉(zhuǎn)運功能。ABCA1主要介導(dǎo)細胞內(nèi)膽固醇流向載脂蛋白，而ABCG1則促進細胞內(nèi)膽固醇流向高密度脂蛋白[11]。因此，ABCA1和ABCG1被認為是抗動脈粥樣硬化的重要靶點。ABCA1與ABCG1均缺陷的巨噬細胞被注入小鼠體內(nèi)，則明顯損害其體內(nèi)巨噬細胞依賴性的膽固醇轉(zhuǎn)運[12]。我們的結(jié)果提示，DMY可能通過增強ABCA1和ABCG1膽固醇轉(zhuǎn)運體蛋白的表達，促進細胞內(nèi)膽固醇排出，從而減少巨噬細胞內(nèi)膽固醇蓄積，抑制泡沫細胞形成。

肝臟是體內(nèi)膽固醇代謝的重要器官。在RCT方面，肝臟上的SR-BI介導(dǎo)細胞選擇性攝取高密度脂蛋白中游離膽固醇和膽固醇酯[13]。在肝臟內(nèi)，肝細胞可通過ABCG5/G8和ABCB11、ABCB4等，分別介導(dǎo)游離膽固醇、膽汁酸、磷脂等分泌到毛細膽管中，最終隨糞便排出體外[14]。CYP7A1是膽汁酸合成經(jīng)典途徑的限速酶，催化膽固醇在肝臟分解為膽汁酸排出體外，在維持膽固醇穩(wěn)態(tài)及膽汁酸合成中發(fā)揮重要作用[15]。我們的結(jié)果顯示，DMY能明顯降低肝臟中脂質(zhì)、膽固醇和甘油三酯含量。DMY對肝臟SR-BI、ABCB4、ABCB11的基因表達無影響，但明顯增強了ABCG5、ABCG8、CYP7A1的mRNA和蛋白表達。以上結(jié)果提示，DMY可通過增強肝臟CYP7A1、ABCG5和ABCG8表達，分別增加肝臟內(nèi)膽固醇的分解和促進其排出。

腸轉(zhuǎn)運膽固醇排出即代表非膽汁途徑 RCT。目前，對于非膽汁途徑 RCT的研究尚處于起步階段。ABCG5/G8可促進膽固醇從腸上皮細胞的頂端膜分泌到腸腔，在腸轉(zhuǎn)運膽固醇排出中起到一定作用[2]。本實驗結(jié)果表明，DMY能增加小腸ABCG5和ABCG8的蛋白表達，提示DMY可通過增強非膽汁途徑 RCT，有助于促進膽固醇的排出。

綜上所述，本研究表明DMY能促進高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠體內(nèi)RCT，即DMY通過上調(diào)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運體蛋白ABCA1和ABCG1，促進巨噬細胞膽固醇外流，通過增強肝臟ABCG5、ABCG8和CYP7A1表達，增加肝臟內(nèi)膽固醇的分解和促進其排出，同時增強小腸ABCG5和ABCG8的蛋白表達，提高非膽汁途徑 RCT。這一作用有助于DMY抗動脈粥樣硬化和調(diào)節(jié)血脂，為DMY在心血管疾病方面的應(yīng)用提供了新的理論基礎(chǔ)。

(致謝：本實驗在南通大學(xué)藥學(xué)院藥理系完成，感謝對實驗給予幫助的老師和同學(xué)。)