越鞠甘麥大棗湯對HT22細胞氧化損傷的修復作用

胡杭琦，薛文達，闞明韻，王 薇

(南京中醫藥大學 1. 基礎醫學院轉化系統生物學和神經科學研究中心中醫腦病重點實驗室、2. 第一臨床醫學院、3. 心理學院，江蘇 南京 210023；4. 南通大學神經再生協同創新中心，江蘇 南通 226001)

越鞠甘麥大棗湯在中醫治療郁證的臨床運用中取得了很好的療效，且毒副作用小[1]。前期實驗發現，越鞠甘麥大棗湯能夠快速修復抑郁小鼠的失樂狀態[2]，其作用機制可能與上調Akt/mTOR信號通路，提高突觸可塑性，以及促進神經元再生有關[3]。本研究擬采用過氧化氫(H2O2)誘導的小鼠海馬神經元細胞系HT22氧化損傷模型[4-5]，探究越鞠甘麥大棗湯的保護作用，有助于指導該方的臨床應用。

1 材料

1.1實驗動物7 ～ 8周齡ICR小鼠，♂，體質量20～22 g，購自南京市江寧區青龍山動物繁殖場，動物合格證號：SCXK(蘇)2014-0002。

1.2藥物實驗用中藥材均購于南京中醫藥大學國醫堂門診。越鞠甘麥大棗湯由蒼術100 g、香附100 g、神曲100 g、梔子100 g、川芎100 g、炙甘草125 g、淮小麥250 g、大棗375 g組成，上述藥物加8倍量水浸泡30 min，沸后煎煮1 h后過濾，再加6倍量水，按上法煎煮后過濾，合并兩次藥液，于65 ℃減壓旋蒸濃縮，濃縮后的藥物濃度為8.3 g·kg-1。

Tab 1 Effects of different concentrations of Yueju Ganmai Dazao decoction serum on survival rate, LDH leakage rate, SOD and MDA of impaired HT22 cells induced by n=6)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

1.3試劑DMEM培養液(HyClone公司)；胎牛血清(Gibco公司)；胰酶細胞消化液(含酚紅)(碧云天公司)；MTT(Solarbio公司)；H2O2(致遠化學制劑有限公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)ELISA試劑盒，均購于南京金益柏生物科技公司。

2 方法

2.1越鞠甘麥大棗湯含藥血清的制備小鼠按10 mL·kg-1的劑量灌胃給藥，每日2次，連續3 d，最后1次灌胃后1 h眼球采血，分離血清，于56 ℃、30 min滅活后過濾除菌，備用。

2.2MTT法檢測HT22細胞的存活率細胞呈對數生長期時，以 6×107·L-1的密度接種培養，18 h后加入H2O2(400、600、800、1 000 μmol·L-1)，處理1 h后，加20 μL MTT，4 h后加入150 μL DMSO，492 nm處檢測OD值。給藥組在H2O2造模后，給予越鞠甘麥大棗湯血清(1%、5%、10%)，作用24 h后，檢測細胞存活率。預給藥組加入不同濃度越鞠甘麥大棗湯血清(1%、5%、10%、20%)預處理24 h，再用H2O2造模1 h后，檢測細胞存活率。

細胞存活率=(造模組A值-調零組A值)/(對照組A值-調零組A值)×100%

2.3ELISA法測定LDH、MDA、SOD濃度取各組細胞培養上清及細胞樣品，按試劑盒說明書操作，分別測定LDH、MDA和SOD濃度。

3 結果

3.1不同濃度H2O2對HT22細胞存活率的影響不同濃度的H2O2均可明顯降低HT22細胞的存活率(P<0.01)。并以600 μmol·L-1(細胞存活率49%)作為后續H2O2造模濃度。

3.2越鞠甘麥大棗湯血清對H2O2損傷的HT22細胞存活率的影響造模后，細胞存活率明顯降低(P<0.01)，5%和10%越鞠甘麥大棗湯血清給藥可以明顯提高細胞存活率(P<0.01，P<0.05)，見Tab 1。

3.3越鞠甘麥大棗湯血清對H2O2損傷的HT22細胞LDH、SOD、MDA的影響Tab 1結果顯示，造模后能明顯增加LDH相對漏出量(P<0.05)，1%、5%、10%越鞠甘麥大棗湯血清給藥均能明顯降低LDH相對漏出量(P<0.01)，且5%給藥濃度效果最好。造模后SOD活性明顯降低(P<0.01)，5%越鞠甘麥大棗湯血清給藥可明顯增強SOD活性(P<0.01)。造模后MDA含量明顯提高(P<0.05)，5%越鞠甘麥大棗湯血清給藥能明顯降低MDA含量(P<0.05)。

3.4預防性給予越鞠甘麥大棗湯血清對H2O2損傷的HT22細胞存活率的影響造模組與越鞠甘麥大棗湯血清預給藥組的細胞存活率均明顯下降(P<0.01)，但造模組與預給藥組之間差異無顯著性(Tab 1)。

4 討論

本研究觀察了越鞠甘麥大棗湯對于小鼠海馬神經元細胞系HT22氧化損傷的修復作用，結果證實，越鞠甘麥大棗湯可以降低胞內LDH漏出率和MDA含量，提高SOD活性，而這種作用不具有預防性，提示其修復作用可能與提高抗氧化能力、抑制氧化應激有關，而其內在機制有待進一步研究。