外用中藥制劑治療濕疹的動物模型評價方法研究進展

余志杰，劉玉杰，王 平，李勁松，徐 穎，孫 濤

(1. 成都中醫藥大學藥學院，中藥材標準化教育部重點實驗室，中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137；2. 廣元市第一人民醫院康復科，四川 廣元 628017)

濕疹是由多種內外因素相互作用引起的表皮及真皮淺層的炎癥性皮膚病，臨床主要表現為瘙癢、丘皰疹、糜爛、結痂、紅斑、苔蘚化等[1]。根據皮膚損害的嚴重程度，濕疹分為急性、亞急性和慢性濕疹。其臨床特征表現為多形性、對稱性、復發性，且病因復雜，病情易反復，嚴重影響了人們的健康生活[2]。中醫稱濕疹為浸淫瘡、濕瘡等，主要與先天稟賦不耐、外邪侵襲有關，以外感風、濕、熱邪為標，臟腑功能失調為本[3]。故中醫采用祛風燥濕、清熱解毒、化腐生肌的治法外治濕疹，其劑型常為膏劑、洗劑、散劑[4]。

現代研究發現，濕疹的病因與遺傳因素、血液循環障礙、精神因素、環境因素(空氣、花粉等)、飲食及細菌感染相關，其發病機制復雜，主要與免疫系統中各種細胞因子水平密切相關[5]。濕疹屬于變態反應性疾病，主要與Ⅰ型變態反應、Ⅳ型變態反應有關，也與瘙癢反應、炎癥、真菌感染密切相關。基于此，本文分析并總結了外用中藥制劑治療濕疹的動物模型評價方法，從主要藥效學實驗(抗過敏、止癢)、輔佐藥效學實驗(抗炎、抑菌)兩個角度，綜述外用中藥制劑治療濕疹的動物模型及機制評價方法，在現有的模型基礎上，改良其造模方法，總結并分析藥效及機制的觀察指標，從而為治療濕疹的外用中藥制劑的開發提供思路和借鑒。

1 抗過敏實驗

1.1抗過敏動物模型建立及宏觀指標評價抗過敏實驗主要動物模型為2,4-二硝基氯苯(2,4-dinitrochlorobenzene, DNCB)/2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB)誘發動物炎癥，從而建立慢性濕疹模型，動物大多選擇小鼠、大鼠，其模型癥狀主要為紅斑、苔蘚化、結痂等，造模評價方法多采用外觀癥狀觀察、組織病理切片及炎癥因子IL-4、IFN-γ指標。DNCB誘導小鼠耳組織慢性濕疹模型表現為耳表皮增厚、充血、血管擴張等癥狀，并通過耳組織病理評分及HE染色，觀察炎性細胞浸潤，綜合評價模型成功與否，以耳腫脹度及炎癥因子作為藥效機制評價指標。具體造模方法見Tab 1。

由此可見，慢性濕疹動物模型主要采用高濃度的DNCB溶液，涂于動物腹部/背部致敏，再以低濃度的DNCB溶液反復耳部激發，模擬臨床皮膚出現紅斑、水腫、結痂、邊界不清、滲出傾向等癥狀，加以病理組織切片微觀觀察，共同確定模型建成與否。國內學者也有采用SD大鼠制備濕疹動物模型，筆者認為大鼠實驗操作方便，背部皮損癥狀易于辨別，腫脹程度較為明顯，且同耳部皮膚相比，與人類皮膚結構更為接近，因此，大鼠也可作為理想的動物模型。而小鼠作為經典的慢性皮炎濕疹模型動物，被廣大研究者所認同，同時，利用豚鼠建立該模型也有少數文獻報道。但部分文獻采用動物性別為♀♂各半，♀動物自身分泌的雌激素具有一定的抗炎作用，故宜采用♂動物建立濕疹模型，以確保實驗設計的嚴謹性。

1.2抗過敏機制有學者認為，Th1/Th2細胞分泌失衡是導致濕疹發病機制之一。研究表明，Th2細胞優勢應答分泌的IL-4與濕疹的發病機制密切相關，但也有學者研究發現，濕疹模型組大鼠耳組織的INF-γ含量比空白組明顯增加[7]。此外，IL-31可以不依賴肥大細胞和淋巴細胞，引起臨床濕疹的組織特征[13]。研究報道，表皮中絲聚合蛋白的缺陷，在濕疹發病機制中具有重要作用[14]。同時，濕疹的發生是以炎癥為基礎，如Tab 1所示，濕疹機制的研究，除測量外周血中IL-1β、IL-4、IL-17、LTB4、INF-γ、TNF-α等，也應重視對皮膚部位相關細胞因子的研究。

2 止癢實驗

2.1止癢動物模型的建立及宏觀指標評價濕疹癥狀中的瘙癢是發生在炎性皮損的皮膚上，因此屬于炎癥性皮膚瘙癢[15]。鑒于此，目前主要采用化學物質作用于動物皮膚上，引發動物瘙抓行為，觀察動物的瘙抓潛伏時間、瘙抓次數、瘙癢介質和炎性細胞因子(Tab 2)。

由Tab 2可知，瘙癢動物模型主要用豚鼠、小鼠。豚鼠雖對外界刺激較為敏感，但成本較高，而小鼠瘙癢模型穩定性和重復性欠佳，其瘙抓反應不易觀察。因此，尚需尋求一種價格合適，對瘙癢較為敏感的動物，如NC/Nga小鼠在屋塵螨的普通環境會出現與人類相似的瘙抓反應[16]。同時，不同動物其瘙癢行為的觀察時間也不相同，這與選擇的動物對瘙癢介質的敏感程度有關。且不同的瘙癢介質導致的瘙癢機制并不相同，如氯喹引起的瘙癢不屬于過敏性疾病，因此，氯喹致癢模型不適用于濕疹引起的瘙癢研究。目前，瘙癢模型大多以單一致癢因素造模，與臨床多因素引發的瘙癢機制區別較大，因此，采用多種方式建立的復雜性瘙癢動物模型與臨床瘙癢發病機制更為相近，如組胺(0.03%)與4-氨基吡啶(0.07%)聯用，可明顯增加豚鼠瘙抓次數[19]。

2.2止癢機制目前瘙癢的發病機制研究較多，但其具體的信號轉導通路尚不清楚。瘙癢介質作用于感覺神經元，傳遞瘙癢的信號。此外，肥大細胞脫顆粒釋放組胺也可引起瘙抓反應，但并不是所有的瘙癢都符合此機制。因此，應結合具體的病情，合理選擇致癢因子作為機制觀察指標。如采用DNCB誘發小鼠濕疹建立瘙癢模型，通過觀察瘙抓次數、P物質、IL-31、組胺等瘙癢介質，研究濕疹與瘙癢的內在關系。此外，Oetjen等[20]研究顯示，IL-4可直接激活小鼠感覺神經元，并進一步證實，慢性瘙癢依賴于神經元IL-4Rα和JAK1信號通路。

3 輔助藥效學實驗

濕疹的炎癥發生在皮膚表層，臨床表現為紅斑、丘疹的癥狀。國內學者采用二甲苯[6-7]、角叉菜膠[7]分別建立急性、亞急性炎癥模型，以腫脹度及病理切片為指標，研究藥物對濕疹的抗炎作用。抗炎機制與IL-1β、IL-4、IL-6等炎癥因子緊密相關。Lee等[21]采用Western blot技術，測定核轉錄因子NF-κB、磷酸化IκBα、MAPKs的表達，評估當歸抗皮膚炎癥的作用機制。另外，濕疹的發生與真菌感染密切相關。因此，也可以臨床濕疹患者分離的菌種為研究對象，收集并總結分析引起濕疹的菌種特點，運用微生物學的研究方法與技術，深入探究濕疹的病因與微生物感染的內在關系。

Tab 1 Establishment of eczema animal models and evaluation indicators

Tab 2 Establishment of pruritus animal models and evaluation indicators

4 小結

綜上，濕疹的臨床癥狀復雜且多變，主要表現為炎癥、瘙癢、滲出等，發病機制復雜，評價治療濕疹的外用制劑藥效及機制研究尚需加強。首先，應圍繞濕疹發病特征為核心，構建并采用與臨床癥狀相符的多因素導致的濕疹動物模型，多角度、多層次全面評價外用中藥制劑治療濕疹的藥效。主要探究外用制劑抗DNCB所致慢性濕疹、止癢的主要藥效學研究；同時，觀察藥物對急性、亞急性炎癥的抗炎作用，也可加強藥物對引發濕疹各種真菌的抑菌效果研究，從抗炎、抑菌的角度，輔助評估外用中藥制劑防治濕疹的藥效。此外，充分利用特定種系和轉基因動物的優勢，如NC/Nga小鼠和高表達的IL-4轉基因小鼠[16,22]。其次，可考慮新型細胞模型的應用。濕疹細胞模型建立主要采用人類肥大細胞HMC-1[23]、角質細胞HaCaT[10]、大鼠嗜堿性白血病細胞RBL-2H3[24]等，體外模型抗過敏機制的研究應結合瘙癢機制的最新研究進展，選擇兩者共同的細胞信號轉導通路，深入探究濕疹與瘙癢的相互聯系。同時，也應重視符合臨床濕疹體外多細胞融合模型的建立，如劉學偉[25]研究發現，濕疹患者淋巴細胞和HaCaT細胞以3 ∶1的比例接種，可建立慢性濕疹體外細胞模型，提示有望用于評價濕疹藥效的體外細胞模型。王南南等[24]采用基因工程技術，成功構建穩定表達hFcεRIα的RBL-2H3細胞，為深入研究變態反應發病機制提供了條件。