川芎提取物對電離輻照損傷實驗小鼠脾臟組織細胞凋亡相關蛋白表達的影響

李 敏，趙 領，劉真宏，羅芳芳,，易輝燕,，趙德華，唐文誠，王繼生,

(1. 西南醫科大學藥學院，四川 瀘州 646000；2. 綿陽市第三人民醫院·四川省精神衛生中心，四川 綿陽 621000)

川芎(LigusticumChuanxiong)為傘形科藁本屬多年生草本植物，具有活血行氣、祛風止痛等功效[1]。電離輻射致機體損傷主要產生自由基、活性氧類和促炎細胞因子/趨化因子，造成DNA、線粒體損傷或細胞凋亡，使基質干細胞的恢復及重新繁殖長期受到損害[2]。以往研究表明，川芎提取物能不同程度發揮對電離輻照損傷小鼠的保護作用。Ramalingam等[3]在細胞培養模型中研究發現，川芎提取物(LigusticumchuanxiongHort. extracts，LCXE)因其強大的供氫能力而具有較強的清除自由基抗氧化能力；Das等[4]研究表明，川芎的主要成分阿魏酸可通過下調硫代巴比妥酸反應產物(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)的形成，上調超氧化物歧化酶及過氧化氫酶活性，從而可預防輻照誘導的氧化應激；Jeong等[5]從川芎中提取出揮發油，經證實其具有抗氧化活性，能夠抑制紫外線造成的DNA損傷，減少p21的表達，增加凋亡調節基因cyclineD1的表達，表明揮發油具有自由基清除能力，對UVB誘導的DNA損傷和細胞凋亡產生抑制作用。而川芎提取物對電離輻射損傷小鼠脾組織細胞凋亡保護機制，未見相關文獻報道。

目前研究表明[6]，線粒體通透性轉變是細胞凋亡發生的先導，Bcl-2家族控制著線粒體外膜和內膜的通透性[7]，其中Bcl-2主要分布于線粒體膜和細胞質中，具有拮抗凋亡的作用。Bax分布于細胞質中，具有促凋亡的作用。p53是核內的一種磷酸化蛋白質，是能夠特異性與DNA序列結合的轉錄因子，當DNA損傷，可引起細胞內p53蛋白水平升高，阻斷細胞增殖，誘導細胞凋亡。本研究針對電離輻射誘導線粒體通路細胞凋亡途徑，研究川芎提取物在該細胞凋亡信號通路中是否具有保護作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 藥物與試劑 川芎提取物，生藥提取率為20 g·L-1，四川同泰植物化工有限公司。氨磷汀(批準文號：國藥準字H20010403)，大連美羅大藥廠。Bcl-2單克隆抗體、Bax單克隆抗體、p53單克隆抗體、DAB顯色試劑盒、免疫組化染色試劑盒、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，均購自北京中杉生物技術有限公司；TUNEL細胞凋亡試劑盒，美國Roche公司；其他試劑均為國產分析純

1.1.2 實驗動物 昆明種♂小鼠120只，清潔級，體質量(20±2)g，由第三軍醫大學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK(軍)2012-0011。飼養環境為晝夜比1 ∶1循環飼養，保持室內濕度 44%～65%，室溫22～26 ℃，給予小鼠正常飲食飲水，適應性飼養1周。所有實驗均經過綿陽市第三人民醫院倫理委員會審核，均遵守實驗動物照料和使用原則。

1.1.3 儀器 TB-718D型包埋機、TKY-TSI型自動組織脫水機、TK-218型恒溫攤片烤片機(湖北泰維科技醫療有限公司)；BMJ-Ⅲ型病理組織包埋冷凍臺(常州市中威電子儀器有限公司)；HM325型手動輪轉切片機(Thermo公司)；AX10 imager A2/AX10 cam HRC正置熒光顯微鏡(Zeiss公司)。

1.2方法

1.2.1 動物分組及給藥方法 設空白組(Normal)、輻照組(ionizing radiation，IR)、氨磷汀組(AMF，腹腔注射260 mg·kg-1)和川芎提取物用藥組(LCXE1、LCXE2、LCXE3，分別灌胃給藥50、100、200 mg·kg-1)。每組20只，輻照前，每天灌胃給藥1次，每次0.5 mL，連續3 d，d 3給藥后30 min即開始60Co γ射線輻照。

1.2.2 主要試劑溶液配制 10 g·L-1中性甲醛溶液：分別稱取無水磷酸氫二鈉0.65 g、Na2HPO4·2H2O 0.8 g于100 mL燒杯后，加ddH2O 85 mL攪拌至完全溶解，緩慢加入CH3OH 15 mL。

1.2.3 建立電離輻照損傷模型及組織的預處理 輻照條件：常規飼養7 d后，采用60Co γ射線全身一次性輻照。輻照條件[8]：5 Gy，輻照率為1.73 Gy·min-1；接受輻照小鼠組別：IR組(陽性對照組)、氨磷汀組、川芎提取物組(50、100、200 mg·kg-1)。小鼠接受輻照后，主要表現為飲水、進食相對減少，行動遲緩，嗜睡，皮毛光澤性稍差，呈微凌亂狀態，偶會有腹瀉，尤其明顯的是，小鼠之間相互靠攏。分別于60Co γ輻照后第72、168 h時摘眼球取血于微量末梢采血管后，用3.5 g·L-1水合氯醛麻醉小鼠，經心臟灌注0.9 g·L-1生理鹽水50 mL，取10 g·L-1中性甲醛50 mL經心臟灌流固定后，取脾臟組織，并置于10 g·L-1中性甲醛中固定30 min。每組10 只。將固定后的組織分裝于對應標記的包埋盒，置于自動組織脫水機中進行脫水處理，包埋，3 μm連續切片。

1.2.4 免疫組化樣品制備與觀察 采用標準免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(streptavidin-perosidase，S-P)染色，加一抗p53(稀釋度 1 ∶150)、Bax(稀釋度 1 ∶200)、Bcl-2(稀釋度 1 ∶100)，具體步驟按S-P法說明書操作，并采用DAB顯色液顯色，中性樹脂封片。結果判定：p53陽性細胞為胞核呈黃色，Bax陽性細胞為胞質和(或)胞核呈黃色，Bcl-2陽性細胞為胞質和(或)核膜呈黃色。在每張切片隨機選取10個400倍視野進行圖像分析，各組選取部位一致。陽性細胞數越多，反映細胞內蛋白免疫活性(表達量)越高。

1.2.5 脾臟組織凋亡細胞的檢測 按TUNEL檢測試劑盒中檢測石蠟切片組織凋亡的說明進行。采用正置熒光顯微鏡鏡下觀察，拍照留存，各組選取部位一致。利用Image-Pro Plus 6.0進行圖像的分析處理，主要測量陽性表達細胞的平均光密度值。

2 結果

2.1川芎提取物對實驗小鼠脾組織凋亡細胞數目的影響采用TUNEL法檢測的凋亡細胞核染棕色，以圓形為主，散在三角形或彎月形染色，總體呈散在分布，正常細胞核染藍色，實驗以陽性細胞數目來衡量DNA受損程度。空白組僅見極少散在的凋亡細胞。與空白組比，IR、LCXE1、LCXE2、LCXE3、AMF組的小鼠脾組織凋亡細胞數量明顯增加，差異具有顯著性(P<0.05)，且IR組顯著性最強(P<0.01)，說明輻照后小鼠脾臟組織細胞凋亡的發生較為明顯。分別于小鼠接受60Co γ射線輻照后72、168 h觀察發現，與IR組比較，LCXE1、LCXE2、AMF組小鼠脾組織TUNEL陽性細胞數量均明顯減少(P<0.01)，且兩觀察點的LCXE1、LCXE2、LCXE3組小鼠脾組織TUNEL陽性細胞數量隨用藥劑量的增加而增加。除空白組外，隨輻照后觀察時間的推移，各組小鼠脾臟凋亡細胞數量均大幅度增加，見Tab 1、Fig 1。

Tab 1 TUNEL staining results of LCXEon apoptosis in splenic tissues of experimental mice n=10)

##P<0.01vsnormal group;*P<0.05,**P<0.01vsIR group

2.2川芎提取物對實驗小鼠脾組織Bcl-2蛋白表達的影響Fig 2、Tab 2結果顯示，正常組僅見極少散在的Bcl-2蛋白陽性染色。隨輻照后觀察時間的推移，各組小鼠脾臟組織Bcl-2蛋白表達量均有所增加。與IR組比，輻照后72 h，AMF、LCXE2、LCXE3組小鼠脾組織Bcl-2蛋白表達明顯增加(P<0.01)；與IR組比，輻照后168 h，AMF、LCXE2、LCXE3組小鼠脾組織Bcl-2蛋白表達明顯增加(P<0.01)。

2.3川芎提取物對實驗小鼠脾組織Bax蛋白表達的影響在小鼠脾臟切片中，Bax陽性表達表現為胞質棕黃色深染。空白組未見Bax陽性表達，IR組在輻照后72 h時已觀察到Bax的陽性表達，隨輻照后時間的推移，Bax陽性表達增強，到168 h時表達明顯高于72 h。與IR組比，輻照后72 h時，AMF、LCXE3組小鼠脾組織Bax蛋白表達量明顯降低(P<0.01)，LCXE2組小鼠脾組織Bax蛋白表達量降低(P<0.05)；與IR組比，輻照后168 h時，AMF組小鼠脾組織Bax蛋白表達量明顯降低(P<0.01)，LCXE2、LCXE3組降低(P<0.05)，見Tab 2、Fig 3。2.4川芎提取物對實驗小鼠脾組織p53蛋白表達的影響在小鼠脾臟組織切片中，空白組見散在少量p53核染陽性表達。比較輻照后72 h和168 h時各組p53蛋白表達量，隨輻照后時間的推移，p53蛋白表達增加，168 h時各組脾組織的p53表達明顯高于72 h；與IR組比，AMF、LCXE2、LCXE3組小鼠脾組織p53蛋白表達量在輻照后72、168 h兩個時間點均明顯降低(P<0.01)，見Tab 2、Fig 4。

Fig 1 Effect of LCXE on the splenic tissue of ionizing radiated mice on the 72nd and 168th hour observed by TUNEL staining (×400)

Fig 2 Expression of Bcl-2 protein in the splenic tissue of ionizing radiated mice at the 72nd and 168th hour(×400)

Fig 3 Expression of Bax protein in the splenic tissue of ionizing radiated mice at the 72nd and 168th hour (×400)

Fig 4 Expression of p53 protein in the splenic tissue of ionizing radiated mice at the 72nd and 168th hour (×400)

GroupDose/mg·kg-1Bcl-2 (OD)72 h168 hBax (OD)72 h168 hp53 (OD)72 h168 hNormal-0.09±0.020.08±0.030.07±0.010.08±0.040.06±0.030.05±0.05IR-0.16±0.05##0.27±0.11##0.32±0.09##0.52±0.13##0.42±0.09##0.63±0.13##AMF2600.41±0.12??0.51±0.17??0.16±0.08??0.31±0.12??0.28±0.10??0.45±0.17??LCXE1500.24±0.080.34±0.13?0.34±0.100.44±0.090.44±0.050.58±0.19LCXE21000.30±0.14??0.48±0.19??0.25±0.08?0.45±0.15?0.31±0.12??0.42±0.14??LCXE32000.33±0.08??0.45±0.12??0.24±0.10??0.41±0.12?0.30±0.11??0.40±0.11??

##P<0.01vsnormal;*P<0.05,**P<0.01vsIR

3 討論

Lomax等[9]研究發現，電離輻照致機體損傷與DNA有關，當DNA損傷或營養缺乏等刺激時，易致MDM2基因抑制，其下游多條信號通路被激活，使得p53蛋白水平明顯升高。而p53可上調Bax蛋白的表達，下調Bcl-2蛋白的表達，促進細胞凋亡[10]。本研究采用小鼠60Co γ輻照方法制備小鼠輻照損傷模型，免疫組化法觀察川芎提取物對電離輻照損傷小鼠脾臟組織凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、p53表達的影響，TUNEL法觀察細胞凋亡，以探討川芎提取物對電離輻照損傷的保護機制。本研究結果顯示，凋亡相關蛋白在正常小鼠脾臟組織中幾乎沒有表達，但在電離輻照損傷后，Bcl-2、p53、Bax蛋白則出現表達。抗凋亡蛋白Bcl-2的過度表達可以阻止p53誘導的細胞凋亡。在不同時間點觀察發現，與IR組相比，AMF、LCXE2、LCXE3組小鼠脾組織Bcl-2蛋白表達量明顯增加，而p53蛋白表達量均明顯降低。說明川芎提取物可能通過上調Bcl-2蛋白，下調p53蛋白的表達，具有抗輻照損傷作用。不過值得注意的是，雖然p53誘導細胞凋亡途徑中的Bcl-2蛋白表達增加，但細胞周期阻滯仍然發生，表明Bcl-2不直接阻斷p53所有功能。因此，Bcl-2(或其他促生存Bcl-2家族成員)是在細胞凋亡信號中下游點，抑制p53誘導的凋亡[11]。在Bcl-2調節的細胞凋亡途徑中，有兩種蛋白受p53的轉錄調控：促凋亡效應分子Bax和Apaf-1(caspase-9激活的支架蛋白)[12]。本研究中，川芎提取物各劑量組輻照損傷小鼠的脾臟組織中Bax、p53蛋白表達均明顯低于輻照組。表明川芎提取物可能通過下調Bax、p53蛋白的表達，從而對電離輻照損傷起到一定的保護作用。

本研究結果發現，川芎提取物對電離輻照損傷小鼠的脾臟組織具有一定的保護作用，其作用機制較為復雜，本文僅從線粒體凋亡通路闡述川芎提取物對電離輻射損傷的保護作用，這種保護作用機制仍需進一步的研究進行證實和補充。另外，川芎提取物在電離輻射損傷小鼠的其他細胞凋亡通路的調控仍需進一步研究。

(致謝：感謝中國工程物理研究院核物理與化學研究所的朱莎老師對動物造模提供幫助，感謝綿陽市第三人民醫院病理科的宋大萍、江葉、袁華、郭敬萍、曾淋老師給予病理技術支持與指導，感謝王蕾、徐敬文、王小紅、歐陽敏、曹莉莎、羅文、郭濠寧、吳思霖在動物實驗中給予支持與幫助。)