胰酶消化時長對GFP轉基因小鼠BMSC傳代生長特性的影響

和法蓮，白盈盈，陳慧芬，李自安，楊建勇，潘興華，劉高米洋

綠色熒光蛋白（GFP）轉基因小鼠的骨髓間充質干細胞（GFP-BMSC）具有自我更新和多向分化潛能，同時又能穩定表達GFP，可作為骨髓間充質干細胞（BMSC）體內示蹤及分化研究的良好工具。筆者的前期研究發現，體外分離培養中小鼠GFP-BMSC的培養不同于人及大鼠，其培養擴增難度高，細胞活性保持時間短，傳代過程中BMSC消化時間長短難以控制，嚴重影響小鼠GFP-BMSC的體外擴增效率。本研究通過比較不同胰酶消化時間對消化過程的影響，優化小鼠BMSC消化時間，為小鼠BMSC的后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 4～8周齡雄性綠色熒光蛋白轉基因小鼠，由醫院動物中心提供，實驗方案經動物實驗倫理委員會批準；DMEM/F12培養基(美國BI公司)、胎牛血清（Hyclone公司）、SW-CL-2F 型百萬層級層流超凈工作臺(蘇州佳寶凈化工程設備有限公司)、二氧化碳培養箱(美國Thermo公司)、倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、0.25% 胰酶(美國BI公司)，成脂、成骨、成軟骨誘導試劑盒（GIBCO公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 BMSC的提取和培養 脫頸處死綠色熒光蛋白轉基因小鼠，75%乙醇皮膚消毒，無菌條件下取股骨及脛骨，浸泡在PBS中，移至超凈工作臺，移除PBS，再用含雙抗1∶100的PBS清洗3遍。用無菌剪剪掉兩側的骨骺端，暴露骨髓腔，放于10 mm培養皿中，用1 ml一次性注射器吸取細胞培養基(含10%FBS的DMEM/F-12)沖洗骨髓腔。沖洗數次直至將絕大部分骨髓沖出，骨髓腔由紅色變成白色為準。用5 ml一次性無菌巴氏滴管，反復在培養皿中吹吸細胞懸液3～5次，盡量使細胞呈單個狀態；再全部轉移到新的10 cm2培養皿中，置于培養箱中培養，此時細胞懸液約5 ml，24 h后補液至10 ml。待細胞融合率約80%～90%時傳代。

1.2.2 胰酶最佳消化時間確定 取P2代純化的含相同細胞量的小鼠BMSC懸液接種于6孔細胞培養板中，待細胞生長融合度達到80%～90%時，用0.25%的胰酶消化 5、10、15和 20 mins，觀察細胞消化程度、細胞形態、死亡細胞碎片的數量，比較不同時間點胰酶對小鼠BMSCs的消化能力。

1.2.3 BMSC誘導分化潛能鑒定

1.2.3.1 成脂誘導 取消化10～15 mins后再次貼壁的P3代小鼠BMSC，按2×104個/cm2的密度接種6孔板中，加入20%FBS的DMEM/F12完全培養基2 ml/孔。將細胞置于5%CO2培養箱中培養，每隔3 d換液，直到細胞融合度達到100%或者過融合。棄上清，加入成脂誘導液，每3 d換1次液。成脂誘導分化結束后，4%中性甲醛溶液固定，油紅O染色，觀察成脂染色效果。

1.2.3.2 成骨誘導 取消化10～15 min后再次貼壁的P3代小鼠BMSC，按2×104個/cm2的密度接種在6孔板中，將細胞置于5%CO2培養箱中培養。每隔3 d換液，直到細胞融合度達到60%，棄上清，加入成骨誘導液，每3 d換1次液；培養至21 d后，4%中性甲醛溶液固定，茜素紅染色，用1×PBS沖洗3次。將培養板置于顯微鏡下觀察成骨染色效果。1.2.3.3 成軟骨誘導 取消化10～15 min后再次貼壁的P3代小鼠BMSC，按5×105個/cm2的密度接種在6孔板中，將細胞置于5%CO2培養箱中培養，貼壁2 h后，棄上清，加入成軟骨誘導液，每3 d換1次液，培養誘導14～28 d后，對軟骨球進行福爾馬林固定和石蠟包埋，進行阿辛藍染色，顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 BMSC分離培養結果 采用全骨髓貼壁培養法分離的小鼠BMSC，接種3 d后，可見大量貼壁細胞生長，呈梭形，上層培養基中懸浮大量的雜細胞；棄上層培養后，并用PBS緩沖液沖洗2遍后，自然光與綠色激發光下，可見形態均一的細胞增殖集落(圖 1a、b)；繼續培養 2～3 d，75%以上細胞融合。 經胰酶消化后1:2傳代，自然光與綠色激發光下，細胞貼壁后呈典型的成纖維細胞形態(圖1c、d)，分布均勻，大小一致。

2.2 不同時間點胰酶消化結果 胰酶消化5 min后，大量細胞仍處于貼壁狀態，無法傳代(圖2a)；胰酶消化10～15 min后，50%～80%細胞縮成圓形，不再貼壁，可用于傳代，顯微鏡下細胞呈單個狀態，死亡碎片較少，且二次貼壁后細胞呈長梭形，表面光滑，具有多向分化潛能(圖2b、c)；胰酶消化20 min后，細胞大部分懸浮，傳代再貼壁后細胞呈寬大扁平狀，表面粗糙，狀態較差(圖2d)。

2.3 BMSC誘導分化能力 體外成脂分化誘導14～21 d后，細胞由長梭形開始收縮、變圓，形態不規則，有脂肪小滴，經油紅O染色后，脂滴明顯紅染（圖3a）；體外成骨分化誘導 14～21 d后，經茜素紅染色后，出現明顯紅染的鈣結節（圖3b）；體外成軟骨分化誘導14～28 d后，石蠟包埋切片，可見軟骨膠原基質中酸性粘多糖經阿利新藍染成藍色（圖3c）。

3 討論

圖1 倒置顯微鏡觀察小鼠熒光BMSC的形態（40×）

圖2 熒光小鼠BMSC的胰酶消化后的貼壁形態（40×）

BMSC是干細胞研究中的一個重點和熱點，因其含量相對較多又易于獲得，體外生長能力強，已被廣泛用于人類疾病動物模型治療研究，但在體內示蹤其遷移、分布、定位及分化困難。綠色熒光蛋白標記技術是近年來細胞標記的主要技術[2]，但GFP慢病毒轉染標記的細胞，其GFP表達存在實效性極不穩定、易熒光淬滅的缺陷，而GFP-BMSC具有綠色熒光蛋白表達穩定、免疫原性較低等特性，為干細胞體內示蹤提供了良好的條件[3-4]。建立完善的GFP轉基因小鼠BMSC的培養體系，是獲得GFPBMSC并用于相關研究的前提和基礎。

圖3 小鼠BMSC誘導潛能結果

人類和大鼠BMSC在傳代過程中，可以用0.25%胰酶消化2 min左右便可使細胞脫落[5-6]，而GFP小鼠的BMSC胰酶消化時間尚不確定，胰酶消化時間過短，GFP-BMSC難以自動脫落；而消化時間過長，胰酶過度與細胞接觸，可破壞細胞表面蛋白和細胞雙層膜，導致細胞破壞、甚至死亡。本實驗結果發現，在胰酶消化5 min時，大部分細胞處于貼壁狀態，只有少量細胞懸浮，不符合細胞傳代要求；在胰酶消化時間為20 min時，細胞全部脫落，但是二次貼壁后，細胞死亡碎片較多且細胞形態不一，不成梭形，不滿足干細胞的形態；而在胰酶消化時間為10、15 min時，大部分細胞變成圓形、脫落，符合傳代要求，且二次貼壁后，細胞狀態良好、呈梭形，具有BMSC的基本形態，誘導分化結果顯示具有成脂、成骨、成軟骨的誘導分化能力。結果說明，用胰酶消化10～15 min不會破壞 GFP-BMSC的細胞形態、傳代生長特性及分化能力。

綜上所述，0.25%胰酶與底物GFP-BMSC的最佳消化時間是10～15 min。相比于人和大鼠消化只需要2 min而言，GFP-BMSC的消化時間是其5～8倍，這一現象可能與其種屬遺傳特性及轉GFP基因有關，但詳細機制有待于進一步研究。

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