“肺氣虛外感”大鼠模型的實(shí)驗(yàn)研究

賀前松，馬 萍，陳 瑤

隨著中醫(yī)藥研究的逐步規(guī)范，動(dòng)物模型的建立已成為評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)研究科學(xué)性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，“肺氣虛外感”證型模型作為諸多慢性肺系疾病的主要研究對(duì)象，其構(gòu)建方法已有多年歷史并且相對(duì)成熟。經(jīng)典的造模方法主要是“煙熏+冷風(fēng)+LPS（脂多糖）”，主要模擬了人體長(zhǎng)期處于空氣污染的大環(huán)境以及風(fēng)寒等外界刺激造成的肺氣虛和以LPS為代表的細(xì)菌或外感因素。而經(jīng)典方法中，LPS注射環(huán)節(jié)過程多為有創(chuàng)性，對(duì)大鼠呼吸道具有一定的機(jī)械損傷，且極易引起術(shù)后傷口感染致死，是“肺氣虛外感”證型模型構(gòu)建過程中比較難攻克的一個(gè)關(guān)卡。本研究中采用改良后經(jīng)口氣管注射LPS的方式，擬以此減輕對(duì)大鼠呼吸道的機(jī)械損傷，降低感染率，更好地模擬肺氣虛外感的病理生理演變過程，并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供更充足地動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠80只，雄性，8 w齡，體重（200±20）g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)：SCXK(川）2015-030)]。

1.2 主要試劑與設(shè)備 黃河天下秀香煙（焦油量9 mg、煙氣煙堿量0.9 mg、煙氣一氧化碳量9 mg）購于川渝中煙工業(yè)有限責(zé)任公司；脂多糖、水合氯醛、PBS溶液、多聚甲醛（EM 級(jí)）、無水乙醇（AR 級(jí)）、二甲苯（AR級(jí)）、蘇木素染液、伊紅染液、中性樹膠、TO型透明液，均購于合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。

轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)購于德國(guó)徠卡，TSJ-Ⅱ型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)、BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀購于常州市中威電子儀器有限公司；BA400Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡、Motic Images Advanced圖像分析軟件購于麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)大鼠購入后稱重，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為正常組和模型組，每組10只。正常組于正常飼養(yǎng)環(huán)境中自由進(jìn)食進(jìn)水喂養(yǎng)，期間記錄大鼠一般情況。

1.3.2 “肺氣虛外感”模型的建立 參照文獻(xiàn)[1-3]的方法，將模型組大鼠置于自制熏箱中，自由進(jìn)食進(jìn)水，每天兩次點(diǎn)燃香煙后連續(xù)煙熏30 min，中間間隔20 min避免窒息。煙熏后，采用風(fēng)扇制冷風(fēng)吹刺激1 h。于第15 d稱重后，水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，然后將其捆綁在自制鼠板上，將大鼠頭朝下呈約30°斜面；用鑷子將鼠舌夾出口腔外，用6 cm小鼠灌胃針仔細(xì)尋找氣管口：針頭到達(dá)大鼠咽喉部后，稍往上抬避免插入食管，感覺阻力后進(jìn)入，上下輕輕推移灌胃針，另一手在大鼠頸部正中摸到氣管軟骨結(jié)構(gòu)隨灌胃針上下浮動(dòng)時(shí)，注入1 mg/ml LPS溶液，0.1 ml/只。迅速松解大鼠，并左右搖晃使LPS均勻分布于大鼠呼吸道內(nèi)，等待麻醉結(jié)束。注射當(dāng)天密切關(guān)注大鼠活動(dòng)，LPS注射后第2 d起，按上方繼續(xù)煙熏+冷風(fēng)刺激6 d。

1.3.3 標(biāo)本取材 于注射LPS后第7 d(造模結(jié)束)，所有大鼠麻醉后脫頸處死，取肺臟、胸腺、脾臟，PBS洗凈擦干后稱重。分別取各組大鼠右肺中葉包被于消毒干棉球中（避免組織含氣量太大上浮于液體表面而固定不完全），置于4%多聚甲醛溶液保存。

1.3.4 病理切片制作 取多聚甲醛充分固定后肺組織，按濃度遞增順序進(jìn)行乙醇脫水處理，期間注意勿在高濃度乙醇溶液中浸泡過久，以防組織變脆，破壞組織結(jié)構(gòu)。脫水后，將肺組織置于TO透明劑中，充分透明后，將標(biāo)本置于混合蠟中進(jìn)行包埋，包埋塊常溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

將包埋組織塊進(jìn)行切片、攤片、烘片，置于TO透明劑中脫蠟20 min，后按脫水相反順序梯度水化。水化后按以下程序進(jìn)行染色：蘇木精染液10～20 min，避開切片位置緩流水水洗，1%鹽酸分色，水洗，50℃溫水中反藍(lán)，水洗，鏡檢染色效果，伊紅染液，水洗，鏡檢著色程度，脫水，TO透明劑Ⅰ、Ⅱ（各1～5 min），中性樹膠封固，鏡檢。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 模型組大鼠煙熏+冷風(fēng)刺激第5 d后，相繼出現(xiàn)活動(dòng)減少、皮毛發(fā)黃稀松脫落、體重增長(zhǎng)減緩、大便變稀，少數(shù)大鼠在煙熏時(shí)出現(xiàn)噴嚏和啰音。在注射LPS后，模型組大鼠均出現(xiàn)啰音，煙熏過程中更加明顯。

2.2 兩組不同時(shí)間體重比較 造模前，兩組體重對(duì)比無顯著差異（P＞0.05）；造模15 d后至造模結(jié)束，與正常組相比，模型組大鼠體重增長(zhǎng)明顯減緩（P＜ 0.01，表 1）。

2.3 兩組臟器指數(shù)比較 按照臟器指數(shù)公式：臟器指數(shù)=（臟器重/體重）×100%，計(jì)算各臟器指數(shù)后發(fā)現(xiàn)，在造模結(jié)束時(shí)，與正常組相比，模型組肺臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺臟器指數(shù)均明顯降低（P＜0.05～P＜ 0.01，表 2）。

表1 兩組不同時(shí)間體重比較(g)

表2 兩組臟器指數(shù)比較(n=10)

2.4 兩組肺組織形態(tài)學(xué)差異 正常組肺間質(zhì)僅少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1），其余基本正常。模型組各級(jí)支氣管管腔擴(kuò)張，黏膜上皮壞死脫落，假復(fù)層纖毛柱狀上皮大片脫失，黏膜下管壁組織疏松、水腫，肺泡壁明顯增厚，血管擴(kuò)張充血（圖2），大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3），肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡壁斷裂、融合（圖 4），形成輕度肺氣腫（圖 5）。

3 討論

在呼吸系統(tǒng)疾病實(shí)驗(yàn)研究中，多選擇以大鼠作為模型動(dòng)物，主要因?yàn)槠渖婺芰涂共∧芰?qiáng)于豚鼠和小鼠，能夠忍受長(zhǎng)時(shí)間的造模過程，體型較小，在造模過程中便于批量復(fù)制和控制。本實(shí)驗(yàn)在造模的過程中，煙熏模擬長(zhǎng)期空氣污染的環(huán)境背景，冷風(fēng)和LPS則扮演著外邪入侵的角色，可以模擬肺氣虛外感證型的發(fā)生發(fā)展過程。本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新之處在于，將經(jīng)典的LPS注射環(huán)節(jié)改良為采用小鼠灌胃針，通過經(jīng)口氣管注射LPS的方法，這樣可以減少直接注射LPS可能造成的對(duì)咽部、氣管的機(jī)械損傷，并減少由此而造成的術(shù)后感染、損傷性炎癥反應(yīng)等干擾因素，能夠更加接近于肺氣虛外感證型的自然發(fā)生、發(fā)展過程，且防止或減少動(dòng)物的意外死亡發(fā)生。

圖1 正常組大鼠肺組織（HE×100）

圖2 模型組大鼠肺組織見血管擴(kuò)張充血（HE ×100）

圖3 模型組大鼠肺組織見炎細(xì)胞浸潤(rùn)（HE ×400）

圖4 模型組大鼠肺組織見肺泡壁斷裂（HE ×400）

圖5 模型組大鼠肺組織見輕度肺氣腫（HE ×100）

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從模型大鼠一般情況、生長(zhǎng)變化、臟器指數(shù)以及肺組織形態(tài)學(xué)變化等來看，大鼠造模后的各項(xiàng)指標(biāo)都較符合“肺氣虛外感”證型，能為后續(xù)研究提供更多的有利條件。

綜上所述，“煙熏+冷風(fēng)刺激+改良經(jīng)口氣管注射LPS”的方式能夠成功建立“肺氣虛外感”大鼠模型，該方法能減輕對(duì)大鼠呼吸道的機(jī)械損傷，減少術(shù)后傷口感染等干擾因素，更符合肺氣虛外感的病理生理演變過程。

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