遼寧絨山羊多胎基因ESR靶標microRNA的篩選

郭 丹，王澤英，張 鵬

（1.遼寧省畜牧科學研究院，遼寧 遼陽 111000；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學，遼寧 沈陽 110866）

雌激素能刺激雌性動物的副性腺和生殖道，引起第二性征的發(fā)育以及性周期的變化，協(xié)同促卵泡生成素（Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）和促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）作用，能使卵泡產(chǎn)生FSH、LH受體[1]。由于雌激素的作用必須通過雌激素受體介導，因此ESR的生物學作用與雌激素的生物學作用密切相關(guān)[2]。雌激素受體（ESR）的E區(qū)是雌激素與受體的結(jié)合區(qū)，能影響雌激素基因在雌性動物組織的表達與調(diào)控，從而對繁殖周期中卵泡的生長發(fā)育發(fā)揮作用[3]。因此，選擇遼寧絨山羊ESR基因位于E區(qū)的外顯子4進行研究，有助于直接了解多羔基因的分子機理，找到多羔基因的特異分子標記。

1 試驗材料

1.1試驗動物試驗所需的組織樣和血樣取自遼寧省畜牧科學研究院提供的遼寧絨山羊。采集10只種母羊的血液保存于加入ACD的血液抗凝管中，存于-70℃冰箱中保存，用于DNA的抽提。

1.2試驗藥品DL 2000 DNA Marker：購自大連寶生物工程有限公司；血液DNA提取試劑盒：購自天根生化科技有限公司；PCR試劑2×Taq PCR MasterMix：購自天根生化科技有限公司。

1.3主要儀器設備超低溫冰箱：NUAIR公司；TC-512型梯度PCR儀：英國TECHNE公司；ChemiDoc XRS數(shù)碼凝膠成像與分析系統(tǒng)：Bio-Rad公司；OYYHZI型、DYY-111-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀:北京六一儀器廠；U-1800紫外分光光度計：HITACHI公司。

2 試驗方法

2.1血液組織DNA的提取室溫解凍血樣，約10 min，取250 μL血樣，利用DNA提取試劑盒進行全血DNA的提取。

2.2 DNA濃度和純度的檢測取2 μL待檢DNA溶液和1 μL 6×loading buffer上樣緩沖液混勻，上樣于1.5%的瓊脂糖凝膠中，120 V電壓電泳30 min。在凝膠成像儀中觀察電泳結(jié)果，并拍照保存，以供分析。

2.3引物設計在NCBI數(shù)據(jù)庫找到羊ESR基因序列（登錄號為cte-mir-279 MI0010083），利用Primer 5.0引物設計軟件，再用軟件Oligo 6進行引物評估，對3′-UTR設計特異引物，由上海生工合成引物。依據(jù)引物設計原則，進行PCR對羊的ESR基因所用引物如表1所示。

2.4基因目的片段的擴增本試驗采用設計的上、下游特異引物，在最適退火溫度條件下獲得ESR基因各個區(qū)段目的片段。用ESR基因的3′-UTR區(qū)域的基因引物進行基因擴增時，需要對組織樣提取的DNA分別進行擴增。然后根據(jù)PCR方法，將檢測后成功獲得的ESR基因的3′-UTR區(qū)域基因擴增產(chǎn)物按1:1比例混勻，將所有成功獲得的ESR基因擴增產(chǎn)物進行測序[4]。測序結(jié)果顯示，3′-UTR區(qū)648 bp處有差異。

表1 ESR基因3′調(diào)控區(qū)目的片段PCR擴增引物Table 1 PCR productsPrimers for 3′control region of ESR

2.4.1 配置25 μL體系反應液2×Taq PCR Master-Mix 2.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上游引物 1 μL，下游引物1 μL，DNA模板1 μL。

2.4.2 PCR反應程序95℃3 min，95℃30 s和54.2℃30 s 30個循環(huán)，72℃2 min，72℃5 min。

2.5序列測定與S N P（單核苷酸突變）定位擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳法檢測，取5 μL擴增產(chǎn)物與1 μL加樣緩沖液混勻，點樣后進行凝膠試驗（1.5%瓊脂糖凝膠），同時加5 μL Marker作參照，在120 V電壓條件下，電泳30 min左右。電泳結(jié)束后，凝膠成像儀檢測目的條帶后拍照，標記，送樣到沈陽生工測序。測序的結(jié)果用DNAMAN 4.0生物軟件進行拼接，進而得到最終目的序列。將目的序列與GenBank中相應基因序列進行比對分析，從而實現(xiàn)基因的序列結(jié)構(gòu)確定[5]。然后利用DNAStar、DNAMAN 4.0、BLAST等軟件與GenBank中序列進行比較分析。

利用數(shù)據(jù)庫和線軟件預測3′端非翻譯區(qū)序列靶標MicroRNA： ①miRBase（http://www.mirbase.org/）MicroRNA預測。②Online microRNA predection tool（http://132.77.150.113/pubs/mir07/mir07_prediction.html）。 ③ RNAhybrid（http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/submission.html）MicroRNA結(jié)構(gòu)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 E S R基因P C R擴增產(chǎn)物普通瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。

3.2篩選得到的mi- R N A的特點測序后通過基因序列與波峰的比對發(fā)現(xiàn)，在ESR基因3′-UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)了1個差異位點，648 bp位點A/T的突變。見圖2和圖3。

3.3microRNA的分離與靶標結(jié)合的特點利用在線軟件查找羊的microRNA，羊的靶標microRNA庫包含137個microRNA，用miRBASE軟件將ESR基因與羊的microRNA結(jié)合情況分析后發(fā)現(xiàn)2個突變前結(jié)合的microRNA，2個突變后結(jié)合的microRNA。

3.3.1 突變前結(jié)合的microRNA cte-miR-278 MIMAT0009538， 通 過 Online microRNA prediction tool在線軟件查到其序列為UCGGUGGGACUUUCGUUCGUUC，通過DNAMAN 4.0生物軟件進行序列比對，得出圖4。

圖1 遼寧絨山羊梯度PCR電泳Fig.1 Liaoning cashmere goat gradient PCR electrophoresis

圖2 遼寧絨山羊ESR基因A/T突變前序列Fig.2 Liaoning cashmere goat ESR gene A/T pre-mutation sequence

圖3 遼寧絨山羊ESR基因A/T突變后序列Fig.3 Liaoning cashmere goat ESR gene A/T mutation sequence

圖4 遼寧絨山羊突變前序列與cte-miR-278序列比對Fig.4 Liaoning cashmere goat mutagenesis sequence alignment with cte-miR-278 sequence

cte-miR-279 MIMAT0009539，通過Online mi-croRNA prediction tool在線軟件查到其序列為UGACUAGAUCCACACUCAUCC，通過DNAMAN 4.0生物軟件進行序列比對，得出圖5。

3.3.2 突變后結(jié)合的microRNA cte-miR-1992 MIMAT0009700， 通 過 Online microRNA prediction tool在線軟件查到其序列為UCAGCAGUUGUACCACUGAUGUG，通過DNAMAN 4.0生物軟件進行序列比對，得出圖6。

圖5 遼寧絨山羊突變前序列與cte-miR-279序列比對Fig.5 Liaoning cashmere goat mutagenesis sequence and cte-miR-279 sequence alignment

圖6 遼寧絨山羊突變后序列與bta-miR-2355-5p序列比對Fig.6 Alignment of bt-miR-2355-5p sequence with Liaoning cashmere goat

cte-miR-1993 MIMAT0009701， 通 過 Online microRNA prediction tool在線軟件查到其序列為UAUUAUGCUGAUAUUCACGAGA，通過DNAMAN 4.0生物軟件進行序列比對，得出圖7。

使用BiBiServ分析microRNA二級結(jié)構(gòu)，ctemiR-12序列為UGAGUAUUACAUCAGGUACUGA，且長度為22 bp，其靶標前體長度為47 bp，mfe值為-22.9 kcal/mol。見圖8。

4 討論

圖7 遼寧絨山羊突變后序列與bta-miR-2461-3p序列比對Fig.7 Alignment of bt-miR-2461-3p sequence with Liaoning cashmere goat mutants

microRNA是一類長度約22 nt的內(nèi)源性非編碼小RNA分子，它能夠通過與靶基因3′非翻譯區(qū)結(jié)合從而抑制靶基因的翻譯或降解靶基因。microRNA參與復雜的生物學過程[6]。microRNA是一組不編碼蛋白質(zhì)自身不具備開放閱讀框架的短序列RNA，在真核生物中廣泛存在，在進化上具有高度保守性，表達上具備嚴格的時空性和組織特異性，且在不同生物體間行使相同的功能。microRNAs在羊絨生長發(fā)育中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。隨著對microRNA的深入研究，已從識別microRNA，闡明作用機制，轉(zhuǎn)移到鑒定其功能。本試驗試圖通過生物信息分析ESR基因3′UTR區(qū)的相關(guān)功能性SNP來篩選不同的microRNA，研究證明，用MicroInspector軟件將靶標基因與山羊的microRNA結(jié)合情況分析后發(fā)現(xiàn)靶標基因的3′-UTR不發(fā)生結(jié)合情況。發(fā)生突變后結(jié)合的ctemiR-278，648 bp位點C到G的突變。分析microRNA二級結(jié)構(gòu)，cte-miR-278序列為ACUGCAGUGAAGGCACUUGUAGCA，且長度為24 bp，mfe值為-22.90 kcal/mol這也意味著，預測得到的潛在靶microRNA即cte-miR-278具有相當穩(wěn)定且重要的意義，可能參與ESR基因的表達調(diào)控。

圖8 cte-miR-12結(jié)構(gòu)的特征Fig.8 Characteristics of cte-miR-12 structure

5 小結(jié)

5.1 遼寧絨山羊群體中ESR基因存在T-305C突變位點，該位點在遼寧絨山羊群體中處于中多態(tài)。

5.2 cte-miR-12有可能調(diào)控ESR基因參與遼寧絨山羊產(chǎn)羔數(shù)的影響。

5.3 本文通過對ESR基因的3′UTR區(qū)突變前后與microRNA的結(jié)合情況進行分析，篩選出相關(guān)microRNA，旨在為今后羊的多態(tài)性的研究提供科學的理論依據(jù)。

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