灌喂氧化魚油后黃顙魚胃腸道黏膜黑色素細胞分化和黑色素合成途徑基因的差異表達

葉元土 吳 萍 蔡春芳 吳代武 羅琪剛 何 杰 高敏敏 周露陽王夢影 汪 冰 張寶彤 蕭培珍

(1. 蘇州大學基礎醫學與生物科學學院, 江蘇省水產動物營養重點實驗室, 蘇州 215123;2. 北京營養源研究所水產動物系統營養研究開放實驗室, 北京 100000)

魚類的色素細胞、色素細胞中的色素是其體色形成的基礎。黑色素細胞的增殖不是源于成熟的黑色素細胞有絲分裂, 而是源于神經嵴(Neural crest)細胞的分化和發育, 來源于神經嵴的干細胞需要遷移到皮膚、眼睛、腹膜等位置分化、發育,經歷了神經嵴干細胞、前黑色素細胞、幼小黑色素細胞、成熟黑色素細胞等基本的分化和發育過程[1,2]。魚類成熟的黑色素細胞主要分布在眼睛、皮膚、鱗片、腹膜等處, 成熟的黑色素細胞顯微鏡下為樹突狀結構, 細胞中的黑素體是由黑色素聚集形成的顆粒狀結構。鱗片、皮膚黏膜下層中成熟黑色素細胞密度、黑色素細胞中黑素體分布位置等決定了魚體黑色體色。

養殖魚類的體色也影響其市場價格, 正常體色也是魚體生理健康的反映[1]。黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)是主要養殖魚類之一, 其體色容易受到自身生理狀態、疾病、水質條件、飼料質量等的影響, 尤其是飼料油脂氧化產物成為飼料途徑影響養殖魚類體色變化的主要因素[1]。由神經嵴細胞分化、發育為成熟的黑色素細胞, 以及黑色素的合成等受到魚體自身內分泌調節、神經調節和外界環境的控制和影響, 其代謝過程也是受到嚴格的、系統的基因表達活性所控制和調節[2]。研究魚類色素細胞的分化、發育和色素合成代謝途徑的基因表達活性, 既是魚類基礎生物學的需要, 也是養殖魚類正常體色維護與調控的需要。對部分養殖魚類色素細胞、黑色素合成過程中主要酶和蛋白質的基因已經有過不同的研究[3,4], 但尚未有系統化的基因信息、基因差異表達等研究。魚體胃腸道黏膜是代謝活躍的器官組織, 也是黑色素合成代謝的主要器官組織之一。本文以灌喂氧化魚油、正常魚油的黃顙魚為試驗對象, 利用其胃腸道黏膜組織為材料, 提取總RNA, 采用RNA-Seq方法得到轉錄組信息; 以轉錄組基因信息為基礎, 分析了黃顙魚黑色素生物合成途徑、黑色素細胞分化發育、黑色素顆粒運動等代謝過程中的蛋白質、酶的基因信息, 以及灌喂氧化魚油、正常魚油后相關基因的差異表達信息, 旨在為同類研究、為黃顙魚色素細胞、黑色素代謝的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗魚

黃顙魚來自于浙江一星集團海鹽試驗基地, 平均體重(78±1.3) g/尾, 共42尾, 其中, 雌性、雄性個體各50%。試驗魚分別飼養于單體容積0.3 m3的6個室內循環水養殖桶中, 每個養殖桶飼養7尾(雌雄混養)。分別設置魚油組、氧化魚油組, 每組各3個平行、共6個養殖桶。用常規飼料養殖15d后開始灌喂氧化魚油、正常魚油。灌喂期間的水溫(24±1.0)℃、溶解氧7.3 mg/L、pH 7.8。

1.2 氧化魚油

魚油為“高美牌”精煉魚油, 氧化魚油按照實驗室建立的方法制備, 魚油、氧化魚油于-20℃保存備用。魚油、氧化魚油和魚漿的氧化程度評價指標見表 1。

由表 1可知, 魚油經過氧化后, 過氧化值增加了21.40倍、酸價增加了3.73倍、丙二醛增加了13.85倍。采用氣相色譜儀, 按照歸一法測定、計算得到魚油、氧化魚油的EPA+DHA含量分別為25.35%和7.62%, 經氧化后, EPA+DHA含量下降了70%。

魚漿按照吳代武等[5]方法制備, 魚漿含水分76.08%、蛋白質17.71%、脂肪3.31%、灰分2.86%。采用液相色譜儀測定魚漿含生物胺含量,結果為組氨44.6 mg/100 g、尸胺230.3 mg/100 g、腐胺71.3 mg/100 g、精胺60.0 mg/100 g和亞精胺110.8 mg/100 g。

表 1 魚油、氧化魚油和魚漿的氧化程度評價指標Tab. 1 Oxidative indexes of fish oil, oxidative fish oil and dissolved fish pulp

1.3 魚油、氧化魚油的灌喂方法

在預試驗中, 將魚油、氧化魚油與大豆磷脂(食用級)分別按照將1鯰1比例混合、乳化后灌喂, 發現黃顙魚出現嘔吐(吐料)情況, 而用實驗室制備的魚漿灌喂則未出現嘔吐(吐料), 經過預試驗按照下述方法制備灌喂用的氧化魚油、魚油。

魚油、氧化魚油分別與大豆磷脂(食品級)以質量比1鯰1比例混合, 攪拌混勻、乳化, 再將經乳化后的油脂與魚漿按照1鯰4的質量比例混合作為灌喂用的灌喂魚油、灌喂氧化魚油(分別含魚油、氧化魚油20%), 于4℃冰箱中保存。每次按照3d的用量進行制備, 以保證灌喂用油脂的新鮮度。

按照實驗室建立的方法[6,7], 于每天上午9:00對試驗魚定量灌喂, 連續灌喂7d。灌喂期間投喂黃顙魚商品飼料。

1.4 RNA樣本采集及總RNA提取

按照葉元土等[6,7]方法, 連續灌喂7d、最后一次灌喂后24h, 每個養殖桶隨機各取3尾、每組共9尾(4尾雌性、5尾雄性個體)用于總RNA提取。

魚體表經75%酒精消毒, 常規解剖, 快速用解剖刀刮取胃和腸道黏膜, 將每尾魚的胃和腸道黏膜混合后, 液氮速凍, 于-80℃保存備用。采樣所用解剖工具均經滅酶、滅菌處理。

魚油、氧化魚油組胃腸道黏膜各9個樣本, 分別用試劑盒(EASYspin Plus)獨立用于提取總RNA,電泳檢測RNA質量。魚油組、氧化魚油組分別選取電泳條帶亮度高、清晰、無拖尾的高質量RNA進行等量混合為魚油組、氧化魚油組各1個樣本(每個樣本至少有5尾試驗魚的總RNA樣本組成),RNA質量約4 μg。同樣方法再混合一個RNA樣本,其余的RNA舍棄。魚油組、氧化魚油組分別得到2個平行樣本用于RNA-seq。

1.5 轉錄組分析方法

RNA-Seq樣品總RNA用DNaseⅠ消化DNA后, 用Oligo d (T)磁珠純化總RNA中的mRNA, 向得到的mRNA中加入適量打斷試劑, 在高溫條件下使其片斷化, 再以片斷后的RNA為模板, 合成cDNA,經過磁珠純化、末端修復、3′末端加堿基A、加測序接頭后, 進行PCR擴增, 構建文庫。構建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus-Real-Time PCR System質檢和測序, 濾除含N比例大于10%、低質量(質量值中位數Q≤25的堿基位點)讀段, 得到過濾后的讀段(clean reads)。讀段長度125 bp。

無參轉錄組的轉錄本拼接經過質控(QC)、過濾后得到的讀段(Clean reads), 用Trinity (版本:v2012-10-05, min_kmer_cov為2)軟件進行無參考基因組的轉錄本拼接[11]。拼接得到266011個轉錄本。

基因功能注釋與分類對拼接好的轉錄本利用不同的數據庫進行unigene基因注釋。各數據庫及功能注釋所用到的軟件及方法: ①與Swiss-Prot、KOG、KEGG GENES序列數據庫的比對采用NCBI blast 2.2.27+。②PFAM蛋白結構域預測采用HMMER 3.0 package, hmmscan。③GO功能注釋為基于Swissprot和Pfam兩部分的蛋白注釋結果, 軟件為Blast2GO v2.5。④KEGG相關注釋為KOBAS。經過Swiss-Prot、KO、GO、KOG、PFAM數據庫進行基因功能注釋, 得到190231個注釋功能的基因。將注釋得到的單一基因序列, 利用NCBI/Blast進行相對于不同物種相同基因的同源性分析。

1.6 基因差異表達分析

以Trinity拼接得到的轉錄組作為參考序列, 采用RSEM軟件(Mismatch 2), 將每個樣品的clean reads對參考序列做比對, 進行基因表達定量。將灌喂氧化魚油的黃顙魚胃腸道黏膜轉錄本表達量與灌喂魚油得到的對應基因表達量對比, 進行差異表達分析。差異表達分析用edgeR軟件包進行分析。對于所有基因, 當其表達量在2個不同樣品間具有差異且統計分析中調整P值(假陽性率)＜0.05時, 認為其在2個不同樣品中具有顯著差異表達。

log2(OFH/FH)為灌喂氧化魚油的黃顙魚胃腸道黏膜某一個基因表達量與灌喂正常魚油胃腸道黏膜相同基因表達量比值以2為底的對數值, 數值為正值表達差異表達上調、負值則為差異表達下調, 數值絕對值越大表示差異越大, 當≥2或≤-2時,視為差異表達顯著。

2 結果

2.1 黑色素生物合成途徑和黑素體運動蛋白基因的差異表達

黑色素是在黑色素細胞內以酪氨酸為底物, 經歷了L-多巴、多巴醌、多巴素等中間產物, 最后合成黑色素、真黑色素、退黑色素(圖1)。黑色素在黑色素細胞內聚集, 形成黑素體, 黑素體是黑色素在黑色素細胞內的存在形式。將轉錄組中涉及黑色素合成途徑和黑素體運動的酶、蛋白的基因信息統計在表 2中。

在表 2中, 涉及黑色素合成有4個基因, 涉及黑素體運動的有3個基因。黑色素合成的酪氨酸酶基因與華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis)酪氨酸酶基因的同源性為49%, 而其他基因與鮭、鯉、斑馬魚、斑點叉尾鲙種類的相同基因的同源性為74%—97%, 具有較高的同源性。

在本試驗的轉錄組結果中, 經過單一基因注釋和灌喂氧化魚油、正常魚油基因表達差異分析, 涉及黑色素生物合成的酶注釋得到了酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關蛋白1(TRP-1)、酪氨酸酶相關蛋白2(TRP-2)、D-多巴色素互變酶-A (DDT-a)共4個酶蛋白的基因, 且經過基因表達差異分析, 這4個酶蛋白的log2(OFH/FH)值分別為-6.00、-5.70、8.46和-2.00, 均達到差異表達顯著性水平, 顯示灌喂氧化魚油后, 導致黑色素細胞內黑色素合成受到顯著性的影響。

圖1 黑色素合成途徑及其催化的酶、蛋白定位框架圖Fig. 1 Melanin synthesis pathway, its enzyme and protein in localization framework map

涉及黑素體運動的有3個主要蛋白質基因被注釋, 分別是Ras相關蛋白Rab的27A (Rab27a)、非常規肌球蛋白-Va (Myosin-Va)、肌球蛋白VIIa-和RAB-相互作用蛋白(MYRIP), log2(OFH/FH)值均未達到差異表達顯著性水平, 顯示灌喂氧化魚油對黑色素細胞內的黑素體運動的蛋白基因表達沒有顯著性的影響。

2.2 α-MSH促進黑色素合成、黑色素細胞發育途徑基因

α-黑素細胞刺激素(Melanocyte-stimulating hormone-α, α-MSH)是一種神經內分泌激素, 通過其受體MC-R等參與對黑色素合成途徑、黑色素細胞的發育和黑色素細胞的遷移等生理代謝的調控作用?？偨Y涉及α-MSH對黑色素細胞發育、黑色素合成的蛋白基因信息見表 3, 共10個基因。經過基因的同源性分析, 這些基因與斑點叉尾鲙、鯉、鯽魚、斑馬魚物種相同基因的同源性為68%—100%,具有較高的同源性。在表 3中, 得到阿黑皮素原(POMC)和阿黑皮素原-2(POMC-2)蛋白基因, 其log2(OFH/FH)值分別為2.40、-5.58, 差異表達顯著。得到黑色素濃縮激素受體1、2、3(MCH-R1、MCH-R2、MC-R3)三種受體, 以及MCH-R1相互作用的鋅指蛋白(MCH-R1-i), 它們的log2(OFH/FH)值分別為0.00、3.04、5.80和-0.50, 顯示只有MCHR2、MC-R3達到差異表達顯著性水平。

在黑色素合成和黑色素細胞分化和發育中, 具有關鍵性調控作用的小眼相關轉錄因子(MITF)的log2(OFH/FH)值為-0.30, 顯示灌喂氧化魚油后MITF基因表達有下調的趨勢, 但未達到顯著性水平。

在不同的調控控制途徑和信號途徑中, 配對盒蛋白PAX-3 (PAX3)與配對域轉錄因子PAX3-A(PAX3-a)、轉錄因子SOX-10(SOX10)得到注釋, 它們的log2(OFH/FH)值分別為-1.40、5.00和-7.14, 顯示灌喂氧化魚油后,PAX3-a差異表達顯著性上調,而SOX10則差異表達顯著性下調,PAX3有下調的趨勢, 但未達到顯著性水平。

上述結果表明, 黃顙魚胃腸道黏膜中存在α-MSH及其受體MCH-R1、MCH-R2、MC-R3基因的表達, 其中,MCH-R2、MC-R3差異表達顯著性上調, 而MCH-R1未顯示差異表達。在黑色素合成、黑色素細胞分化、發育中具有關鍵性作用的MITF基因有差異表達下調的趨勢。對MITF轉錄其調控的SOX10、PAX3、PAX3-a的表達也受到影響,顯示差異表達。

表 2 黃顙魚黑色素合成與黑素體在細胞內運動蛋白質的基因信息Tab. 2 Genes associated with melanin synthesis and cellular melanosome movement

2.3 調控神經嵴細胞分化為黑色素細胞的三個信號途徑基因

調控神經嵴干細胞分化為前黑色素細胞、黑色素細胞發育的信號途徑主要有KIT及其配體KITL信號通路、WNT/β-catenin信號通路、EDN3和EDNRB信號通路, 依據轉錄組單一基因注釋、KEGG通路注釋、GO功能注釋等結果, 總結涉及上述3個信號通路的相關蛋白基因信息見表 4, 共有15個基因。經過基因的同源性分析, 這15個基因與鯉、斑點叉尾鲙、金線鲃、鯽等物質相同基因的同源性為91%—100%, 具有很高的基因同源性。

由表 4可知, 在KIT及其配體KITL信號通路中,注釋得到原癌基因Kit配體(KITL)、肥大/干細胞生長因子受體(KITA或SCFR), 其log2(OFH/FH)值分別為-0.35、0.21, 有差異表達, 但均不顯著。對于WNT/β-catenin信號通路, 注釋得到β-連環蛋白(β-Catenin)、淋巴增強結合因子1/T細胞特異性轉錄因子1-α(LEF-1/TCF1-α)、環AMP應答元件結合蛋白1(CREB-1)基因, 它們的log2(OFH/FH)值分別為-0.10、-0.99和0.10, 有差異表達但未達到顯著性水平。關于EDN3和EDNRB信號通路, 注釋得到內皮素-1(ET-1)、內皮素-2(ET-2)、內皮素-1受體(EDNRA)、內皮素B受體(EDNRB)基因, 它們的log2(OFH/FH)值分別為2.71、4.37、0.83和-0.20,其中,ET-1和ET-2基因差異表達達到顯著性水平。

在涉及的3個信號通路中, 細胞內信號傳遞的主要蛋白基因注釋結果見表 4。主要有Rho相關GTP結合蛋白的Rho (RHOU)、RHOGTP酶激活蛋白32 Rho (ARHGAP32)、鈣調蛋白激酶Ⅱ的α鏈(CaMKⅡ)、cAMP依賴性蛋白激酶催化亞單位α(PRKACA)、cAMP依賴性蛋白激酶催化亞單位β(PRKACB)、cAMP依賴性蛋白激酶II型-α調節亞基(PRKAR2A)得到注釋, 它們的log2(OFH/FH)值分別為4.64、-0.80、-6.50、0.58、0.39和-0.69, 其中,RHOU、CaMKⅡ差異表達顯著, 其余的有差異表達但不顯著。

表 3 α-MSH對黑色素細胞發育、黑色素合成的蛋白基因Tab. 3 Effects of α-MSH pathway genes on the development of the melanocyte and melanin synthesis

表 4 調控黑色素細胞分化和發育的3個信號通路的基因Tab. 4 Genes in three signaling pathways modulate melanocyte differentiation and development

3 討論

魚類體色的形成與體色變化受到體內因素和環境因素的多重影響, 本文主要反映了灌胃氧化魚油后, 涉及黃顙魚胃腸道黏膜中黑色素細胞分化和發育、黑色素生物合成、黑素體在黑色素細胞內的運動的有關酶和蛋白質的基因的差異表達信息。成熟的黑色素細胞數量和密度、黑色素細胞中黑色素的數量、黑色素細胞中黑素體的運動與分布狀態等是魚體黑色體色的形成、黑色體色變化的生物學基礎, 而這些生理過程是在嚴格的生理環境、基因表達調控等作用下進行的[1,2]。

3.1 黑色素的生物合成途徑

黑色素是在黑色素細胞內, 以酪氨酸為原料,在系列酶和蛋白質作用下、經過系列反應過程而合成?？偨Y黑色素合成途徑、并將控制代謝反應的酶和蛋白定位于合成途徑之中, 涉及代謝反應的酶或蛋白質, 及其log2(OFH/FH)值用斜體、加粗標示(圖1)。

深度學習發生與否的重要特征不僅僅是促進生活經驗與所學知識相互轉化，還更應當讓學生能夠主動地內化吸收知識，培養其將所學知識轉化為社會實踐的能力。除了深度學習對實踐與應用的要求很高，其實在面向社會生產生活與未來社會的要求下，培養的學生是否具備將所學知識轉化為現實應用的實踐能力已經成為了個人、社會乃至國家發展的關鍵所在。筆者在經過多次的教學實踐發現： 將學生所學的知識在復習課中按照一定的社會情境問題組成探究化主線進行教學，讓學生在解決實際生產問題中不斷探究、逐層深入，該過程就可以讓學生根據所學知識不斷解決生產實踐的相關問題。

黑色素細胞內黑色素合成代謝反應鏈的關鍵酶是酪氨酸酶(Tyrosinase, TYR), 控制了反應鏈的代謝速度, 是限速酶。由圖1可知, 酪氨酸酶主要參與2個反應過程: 催化L-酪氨酸羥基化轉變為L-多巴、氧化L-多巴形成多巴醌, 多巴醌經一系列反應后形成黑色素; 在5,6-二羥基吲哚轉化為吲哚5,6-醌(Indole5,6-quinone)的過程中, 也是受到酪氨酸酶的催化作用。酪氨酸酶的催化作用還需要2個重要蛋白的參與, 即酪氨酸酶相關蛋白1和2(TRP-1、TRP-2), 酪氨酸酶相關蛋白2又稱為L-多巴色素互變異構酶(L-dopachrome tautomerase, DCT), 在多巴醌(DOPA quinone)轉化為吲哚5,6-醌-2-羧酸(Indole 5,6-quinone carboxylic acid)、多巴色素(DOPA chrome)轉化為5,6-二羥基吲哚羧酸(DHICA)的反應中發揮作用, 同時該步反應還有D-多巴色素互變酶-A (D-dopachrome tautomerase-A, DDT-A)的參與。在本試驗中, 在黃顙魚胃腸道黏膜轉錄組中,注釋得到了上述酶和蛋白質的基因信息; 差異表達分析結果顯示, 灌喂氧化魚油后, 酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關蛋白1(TRP1)的log2(OFH/FH)值分別為-6.00、-5.70, 均是差異表達顯著下調; 而酪氨酸酶相關蛋白2(TRP2)的log2(OFH/FH)值為8.40, 則是差異表達顯著上調, 由于TRP2同時還具有L-多巴色素互變異構酶的作用, 因此, 在灌喂氧化魚油后,黃顙魚胃腸道黏膜黑色素細胞中黑色素的生物合成代謝受到顯著性的影響, 酪氨酸酶、酪氨酸酶相關蛋白1的基因表達是顯著下調的。在多巴色素互變構型變化調節反應中, L-多巴色素互變異構酶蛋白基因表達是顯著上調、而D-多巴色素互變酶-A蛋白基因差異表達是顯著下調。

包括黃顙魚在內的淡水魚類, 酪氨酸酶在皮膚、鱗片、血清中均有分布, 且酪氨酸酶活力大小與魚體體表黑色顏色的深淺直接成正相關關系、在不同部位酪氨酸酶活力大小與魚體黑色素合成部位有關[1,8]。從圖1的代謝途徑以及相關酶蛋白在代謝鏈中的定位結果看, 可以發現: 在灌喂氧化魚油急性損傷后, 黃顙魚胃腸道黑色素細胞合成黑色素的代謝限速反應階段是代謝下調的, 而由L-多巴醌、多巴色素異構化為真黑色素的反應過程則是上調的、D多巴醌異構化為真黑色素的反應過程則是上調的[DCT的log2(OFH/FH)值為8.40]。結果表明, 在灌喂氧化魚油的條件下, 黃顙魚胃腸道黏膜中黑色素生物合成代謝關鍵酶基因差異表達顯著下調、黑色素的合成可能受到顯著性的抑制作用。同時, 即使在黑色素合成反應受到下調影響的情況下, 還是可以將L-多巴醌、多巴色素更多地異構化為真黑色素, 而D-多巴醌異構化為真黑色素的反應是下調[DDT的log2(OFH/FH)值為-2.00]。這或許也是一種生理適應性反應。

3.2 黑素體運動有關的蛋白基因差異表達

黑色素細胞是一類樹突狀的細胞, 細胞有很多的樹突狀枝突, 黑色素合成后形成黑素體。當黑素體在黑色素細胞中央部分集中、枝突中缺少黑素體時, 魚體的體色變淺; 當黑素體從細胞中央運輸到枝突中在枝突中的分布密度增大時, 魚體的體色加深、為深黑色體色[1,2]。

黑素體在黑色素細胞內的運輸主要是沿著微管且以微管形成或解體作為動力。有兩類微管蛋白:驅動蛋白(Kinesin)和細胞質動力蛋白(Cyto-plasmic-dynein)參與黑素體的運輸。有資料表明[2,9], 黑素體依賴Rab27a (Ras相關蛋白Rab-27)、非常規肌球蛋白-VA (Myosin-Va)、肌球蛋白VIIa-和RAB-相互作用蛋白(Melanophilin)結合于微管蛋白上、并依賴驅動蛋白和動力蛋白的活動實現黑素體在黑色素細胞內的運動, 且這種運動是雙向的: 由細胞核周圍向樹突狀分枝運輸、由樹突狀分枝向細胞核周圍運輸。Rab27a是一種組織特異性蛋白, 活性形式GTP-Rab27a連接到黑素小體膜上, 通過與Myosin-Va相互作用將黑素體連接到肌球蛋白-Va上。因此, Rab27a、Myosin-Va、Melanophilin是黑素體與微管結合并在微管上運輸的關鍵性蛋白。在灌喂氧化魚油后, 它們的的log2(OFH/FH)值分別為0.89、-0.80和0.10三種蛋白基因有差異表達, 但不顯著, 表明在灌喂氧化魚油造成急性損傷后, 雖然黃顙魚黑色素細胞內黑色素的生物合成有顯著性的變化, 但細胞內黑素體運動相關蛋白表達活性沒有顯著性的變化。

3.3 α-MSH和3個細胞信號通路對黑色素細胞分化、發育的調控作用

黑色素細胞數量的增加不是細胞有絲分裂增殖, 而是由神經嵴細胞分化發育而來[2,3]。神經嵴是脊椎動物胚胎早期發育過程中出現的暫時性結構, 神經嵴干細胞就是由神經板邊緣區域的細胞發育來的。由神經嵴細胞分化為黑色素細胞, 大致經歷了神經嵴細胞、成黑色素細胞和黑色素細胞3個階段, 在黑色素細胞分化、發育過程中, 同時進行著黑色素的合成、黑素體的運動。

神經嵴細胞具有多向分化的潛能性和遷移性,是一類具有多種分化潛能的干細胞, 從神經嵴細胞發育為成熟的黑色素細胞是其分化潛能之一。由神經嵴細胞分化發育為黑色素細胞要經歷復雜的細胞遷移、細胞分化、細胞定向增殖和發育等過程,其發育過程是受到細胞外部環境和嚴格的基因表達編排共同發揮作用、且相互影響的復雜結果, 同樣也受到基因網絡調控, 這個過程中的信號通路主要包括: 黑色素合成激素α-MSH的調控和3個細胞信號通路WNT/β-catenin信號通路、EDN3和EDNRB信號通路、KIT及其配體KITL信號通路[2,10,11]。

α黑素細胞刺激激素(α-Melanocyte stimulating hormone, α-MSH)是4種黑素細胞刺激素(Melanocyte-stimulating hormone, MSH)的一種, 屬于神經內分泌激素, 含有13個氨基酸殘基, 其前體為阿黑皮素原(Pro-opiomelanocortin, POMC)。POMC可在腦垂體、下丘腦及神經系統其他部位、胃腸道和皮膚中產生[13]。POMC水解成ACTH (促腎上腺皮質激素adreno-cortico-tropic-hormone)、β-促脂解素、β-內啡肽和γ-MSH, ACTH在酶的作用下可繼續降解為α-MSH, α-MSH就是ACTH分子的l—13氨基酸組成。α-MSH的生理作用是直接激活其受體MC-1R, 使黑素細胞內酪氨酸酶的表達增加、活性增強, 從而使黑素合成量增加; α-MSH還通過影響黑素細胞的增生、樹突形成、對黑素細胞的免疫保護作用等。在本試驗中, 注釋得到阿黑皮素原(Proopiomelanocortin, POMC)和阿黑皮素原-2(Proopiomelanocortin-2, POMC-2)2種α-MSH前體, 它們的log2(OFH/FH)值分別為2.40、-5.58, 前者差異表達顯著上調, 而后者差異表達顯著下調。α-MSH的3種受體MCH-R1、MCH-R2、MC-R3得到成功的注釋, 它們的log2(OFH/FH)值分別0.00、3.04和5.80, 顯示MCH-R2、MC-R3差異表達顯著上調。這個結果顯示, 在黃顙魚胃腸道黏膜中也存在α-MSH調控途徑, 其主要基因的差異表達受到灌喂氧化魚油的顯著影響, 體現在α-MSH前體POMC、POMC-2的表達活性顯著性變化, α-MSH的受體MCH-R2、MC-R3差異表達顯著上調。

WNT信號通路在神經嵴干細胞發育的各個階段都能發揮作用, 也包括神經嵴肝細胞分化為黑色素細胞的分化和發育過程。作用途徑首先是通過活化其受體Frizzled, 隨后激活下游的信號轉導分子, 如β-catenin、PKC、CAMKII、PKA和Rho GTPase等, 然后啟動細胞內的復雜反應。在本試驗中,β-Catenin、LEF-1/TCF1-α、CREB-1在黃顙魚胃腸道黏膜中被注釋, 它們的log2(OFH/FH)值分別為-0.10、-0.99和0.10, 有差異表達但未達到顯著性水平。

EDN3和EDNRB信號通路。EDN3為內皮素-3endothelin 3, EDNRB為內皮素受體B, EDNRB與EDN3結合, 活化下游的信號轉導分子PKC、CamK II和MAPK, 繼而引發細胞內復雜的生理應答, 該信號通路對于神經嵴來源的黑色素細胞和腸神經節的發育是非常重要的, 對于黑色素細胞發育分化所需的Tyr酶表達起至關重要作用。注釋到EDNRA、EDNRB二種受體, 它們的log2(OFH/FH)值分別為0.83和-0.20; 同時,ET-1、ET-2基因也被注釋, 它們的log2(OFH/FH)值分別為2.71和4.37, 差異表達顯著性上調。

上述結果顯示, 黃顙魚被灌喂氧化魚油后, 在胃腸道黏膜中, 黑色素合成激素α-MSH前體的基因、α-MSH受體MCH-R2、MC-R3差異表達顯著上調; WNT/β-catenin信號通路、EDN3和EDNRB信號通路、KIT及其配體KITL信號通路的有關基因受到灌喂氧化魚油的影響有差異表達, 但未達到顯著性水平。是否可以認為, 黃顙魚胃腸道黏膜中黑色素細胞分化與發育受α-MSH通路的影響較大, 即受到激素調控的影響更大, 而受其他3個信號通路的影響較??？這需要進一步的研究。

3.4 黑色素代謝和黑色素細胞發育的幾個關鍵性基因的差異表達分析

從圖2可見, 不同的信號通路通過對CREB、PAX3和PAX3-a、SOX10等靶基因的調控, 調節MITF的表達活性, 再對下游的TYR、TRP-1和TRP-2的表達進行調控, 從而實現對黑色素生物合成、黑素體在黑色素細胞內的運動、對黑色素細胞的分化和發育的調控作用。

SOX10是轉錄因子中High-mobility group-domain SOX家族成員,SOX10基因在黑色素細胞形成過程中也發揮著重要作用, 它調控MITF基因的表達從而調控黑色素的遷移和分化[13,14]。SOX10基因還可調控黑色素合成途徑的L-多巴色素互變異構酶(DCT)又稱為酪氨酸酶相關蛋白2(TRP-2)基因的表達。SOX10受到EDN3-EDNRB信號通路的調控,同樣也受到WNT/β-catenin信號通路的影響[15]。在本試驗中,SOX10的log2(OFH/FH)值為-7.14, 為差異表達顯著性下調;DCT的log2(OFH/FH)值為8.40,為差異表達顯著性上調。這表明SOX10的表達受到灌喂氧化魚油的影響很大, 雖然導致對其下游基因如Miitf基因的表達受到顯著影響, 但L-多巴色素的異構化是增強的。

PAX3和SOX10協同作用激活MITF啟動子, 激活MITF的表達, 進而促進黑色素合成關鍵酶如TRP-1、TRY、DCT等的表達增加[15]。在本試驗中,PAX3的log2(OFH/FH)值為-1.40;SOX10的log2(OFH/FH)值為-7.14, 都是差異表達下調, 顯示對其下游基因的調控作用下降, 會影響到黑色素的生物合成, 是黑色素生物合成量呈現下降趨勢。

MITF作為色素細胞信號轉導途徑下游的一個信號分子, 介導了多種信號級聯過程, 在色素細胞發育、分化和功能調節中起到關鍵性作用, 因此它可以作為關鍵性靶位, 用于研究其他相關基因[16]。MITF可調控酪氨酸基因家族的表達, 從而參與黑色素細胞中黑色素生成的調控。在本試驗中,MITF的log2(OFH/FH)值為-0.30, 為差異表達下調。

圖2 黃顙魚黑色素細胞分化與發育過程中的激素與信號通路基因網絡Fig. 2 Gene network of hormone and signaling pathways during melanoma cell differentiation and development process

從上述幾個關鍵基因的差異表達結果看, 黃顙魚在灌喂氧化魚油后, 其胃腸道黏膜組織中, 涉及黑色素細胞分化、發育和成熟, 以及涉及黑色素生物合成、黑素體在黑色素細胞內運動的主要基因顯示差異表達, 總體上是差異表達下調的趨勢, 而涉及L-多巴色素的異構化的反應是增強的。因此,可以認為, 灌喂氧化魚油對黑色素細胞的分化、發育、成熟, 以及黑色素的生物合成、黑素體運動等的影響是負面的, 可能導致成熟的黑色素細胞數量不足、皮膚中成熟的黑色素細胞密度下降、黑色素數量下降, 導致黃顙魚黑色體色變化, 黑色體色不足, 而出現體色變淺的情況; 同時, 由于黃顙魚能夠吸收、并沉積飼料來源的黃色素, 在黑色素、黑色體色不足的情況下, 魚體出現黃色體色。

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