中華鱘促性腺激素釋放激素受體基因cDNA序列的克隆及表達分析

王桂蘋 杜合軍 冷小茜 李創舉 曹 宏

(1. 中國科學院水生生物研究所 淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 三峽工程魚類資源保護湖北省重點實驗室, 中國長江三峽集團公司中華鱘研究所, 宜昌 443100; 3. 中國水產科學院長江水產研究所, 武漢 430223)

促性腺激素釋放激素受體(GnRH-R)的cDNA序列最早是在小鼠(Mus musculus)中被克隆鑒定出來[1], 隨后在非洲爪蟾(Xenopus laevis)的卵母細胞中進行了功能驗證[2]。在魚類中, 促性腺激素釋放激素(GnRH)參與了包括繁殖在內的多個生理學進程, 和哺乳動物一樣, 通過其與GnRH-R相結合, 合成并釋放促性腺激素, 從而促進性腺的成熟[3]。目前,GnRH-R基因序列已在多種魚類上有相關報道,包括虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[4]、伯氏樸麗魚(Haplochromis burtoni)[5]、真鯛(Pagrus major)[6]、斑紋隱小鳉(Kryptolebias marmoratus)[7]、日本鰻鱺(Anguilla japonica)[8]、歐洲舌齒鱸(Dicentrarchus labrax)[9]和革胡子鯰(Clarias gariepinus)[10]等。

中華鱘(Acipenser sinensis)是我國的一級保護動物, 其隸屬于硬骨魚綱、軟骨硬鱗總目、鱘形目、鱘科、鱘屬魚類, 國際自然保護聯盟(IUCN)瀕危級(Endangered, EN)物種, 國際瀕危動植物種貿易公約(CITES)附錄Ⅱ保護物種。其壽命長, 體型大, 初次性成熟年齡大(雌性: 14—26年; 雄性:8—18年), 產卵間隔期長(約2—7年); 而且, 中華鱘是1種溯河洄游性魚類, 棲息空間跨度大, 種群一旦遭到破壞, 就很難恢復。近幾十年來, 由于人類活動的影響(如過度捕撈、航運、污染和水利工程等), 造成中華鱘的棲息地和產卵場遭到嚴重破壞,尤其是長江中游葛洲壩水利工程和三峽工程的修建阻斷了中華鱘的產卵洄游路線, 導致中華鱘產卵量急劇減少, 野生資源量持續下降[11]。因此, 自20世紀80年代起, 我國學者對中華鱘進行了資源動態[11,12]、遺傳多樣性[13]、人工繁殖及幼魚的培育[14,15]等理論和應用研究, 經過30余年的不懈努力,目前, 已成功實現中華鱘全人工繁殖[16]。但是, 人工養殖成魚和親魚前期培育所需要的時間長、人力、物力投入巨大。本研究通過基因同源克隆, 獲得了中華鱘GnRH-R基因的cDNA序列, 并對其序列特征、同源性、組織表達特征進行了分析, 以期為進一步研究其生長生殖調控功能提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

用于構建垂體SMART cDNA質粒文庫的野生中華鱘由中國水產科學院長江水產研究所于2005年11月(中華鱘的繁殖季節) 于長江中捕獲。其性別鑒定為雌性, 年齡鑒定為24 齡, 全長303 cm, 體長247 cm, 體重192 kg。養殖中華鱘取自中國長江三峽集團公司中華鱘研究所, 選取健康無損傷的3齡子二代中華鱘3尾, 經麻醉、放血, 取心、肝、脾、腎、腸道、肌肉、精巢及腦組織, 在液氮中速凍,然后存放于-80℃冰箱備用。

1.2 垂體RNA的提取及SMART cDNA的合成

將中華鱘垂體組織取出后, 利用SV Total RNA Isolation System試劑盒(Promega)提取總RNA, 步驟詳見SV Total RNA Isolation System Promega操作手冊, 中華鱘垂體SMART cDNA的合成步驟參照文獻[17]。

1.3 垂體庫的克隆、測序及數據分析

取合成好的中華鱘垂體SMART cDNA文庫,對其進行克隆, 測序分析, 具體步驟參照文獻[17]。將測序得到的SMART cDNA文庫中全部小于200 bp的測序結果廢棄不用, 對剩下的測序結果通過blastclust方法(ftp.ncbi.nih.gov/blast)進行聚類并通過CAP3軟件(http://seq.cs.iastate.edu/download.html)來進行功能匯編。并和公共數據庫GenBank里的蛋白質和核酸數據進行比對分析, 只有e-value值≤10-5的才被認為是可靠的數據。

1.4 中華鱘GnRH-R基因的全長cDNA序列的擴增與序列分析

以中華鱘垂體SMART cDNA文庫為模板, 所用RACE PCR引物為: 3′-GnRH-R RACE-PCR:ATATCTCGAGCTAATGAAATACAGTACGGGG GTA; 5′-GnRH-R RACE-PCR: ATATCTCGAG CTAATGAAATACAGTACGGGGGTA; UPM: CTA ATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTA TCAACGCAGAGT; 其具體RACE PCR步驟參照文獻[18]。

1.5 GnRH-R基因的序列分析及系統進化樹的構建

將所得序列利用Blast軟件進行同源性分析, 利用ORF Finder查找開放閱讀框, 并推導其相應的氨基酸序列; 通過NetNGlyc 1.0軟件來預測N連糖基化位點。從GenBank中查詢出所有已有的魚類GnRH-R基因cDNA序列, 利用Cluster X進行氨基酸序列多重比對, 并以米氏葉吻銀鮫的GnRH-R為外類群(NP_001279833), 用Mega 4 軟件中的鄰接法(Neighbourjoining)及最大簡約法(Maximum parsimony)對相關蛋白質構建系統發育樹, 用自展法(Bootstrap) 進行系統樹評估, 一致性指數(Consistency index,CI)來衡量分析結果的可靠性。

1.6 實時熒光定量PCR

利用SV Total RNA Isolation System試劑盒(Promega) 提取中華鱘的心、肝、脾、腎、腸道、精巢、肌肉及腦組織用于組織表達特征研究; 步驟詳見SV Total RNA Isolation System Promega操作手冊。所得總RNA經瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計檢測, 取各組織總RNA 0.1 μg, 利用M-MLV逆轉錄酶及oligo (dT)18引物(Promega), 按操作說明將其合成第1鏈cDNA, 以此為模板。熒光定量PCR采用引物為:GnRHR-rtime-F: GAATGTCACAGTTCAGT GGCTCG;GnRHR-rtime-R: TTTCTTCTTCGCT TCGTTGATG; 內參引物為: β-actin-F: TGGACT TGGCTGGTCGTGAC; β-actin-R: CTGGCAGCT CATAGCTCTTC。其他具體步驟參見文獻[18]。

2 結果

2.1 中華鱘GnRH-R基因的cDNA全長序列及其推導的氨基酸序列

中華鱘GnRH-R基因cDNA全長1530 bp, 有478 bp的5′非翻譯區, 579 bp的開放閱讀框和473 bp的3′非翻譯區, 編碼192個氨基酸, 在poly (A)尾巴前18 bp處有一個典型的加尾信號(AATAAA)。通過軟件NetNGlyc 1.0進行N連糖基化位點的預測, 結果表明,GnRH-R的氨基酸序列存在5個潛在的N連糖基化位點(Asn2、Asn24、Asn 37、Asn 91和Asn 111)。該序列的NCBI Bank ID是2033544。

2.2 中華鱘GnRH-R基因氨基酸序列的同源性分析

運用BLAST軟件對中華鱘GnRH-R蛋白進行了氨基酸序列同源性分析(表 1)。結果表明, 在所有序列中, 和中華鱘GnRH-R的氨基酸序列相比較, 同源性范圍為 39%—76%, 其中, 與真鯛GnRH-R的同源性最高, 為76%, 而與軟骨魚類——米氏葉吻銀鮫的GnRH-R的同源性最低, 為39%。

我們將中華鱘GnRH-R和其他魚類的GnRHR的氨基酸序列進行了分析。利用Mega 4.0 軟件,分別利用鄰接法及最大簡約法構建了進化樹(圖1)。 結果發現, 以銀鮫目的米氏葉吻銀鮫為外類群, 鰻鱺目的日本鰻鱺、鲇形目的革胡子鯰、鮭形目的虹鱒, 以及鱸形目的伯氏樸麗魚可以聚類為一個分支; 中華鱘則與腔棘魚目的矛尾魚(Latimeria chalumnae)與其他魚類如鳉形目的斑紋隱小鳉、底鳉(Fundulus heteroclitus)以及鱸形目、鰈形目、鲉形目等代表物種聚為另一個分支。從圖中的結果看, 雖然兩棵樹之間存在一些細微差異, 主要體現在有幾個支持率比較低的節點上, 但是幾個關鍵節點的支持率還比較高, 在90%以上, 例如, 以銀鮫目的米氏葉吻銀鮫為外類群, 鰻鱺目的日本鰻鱺、鲇形目的革胡子鯰、鮭形目的虹鱒, 以及鱸形目的伯氏樸麗魚可以聚類一個分支, 2棵進化樹都顯示這幾個物種聚類為一個分支, 支持率分別為100%和97%。

表 1 中華鱘的GnRH-R基因與其他魚類氨基酸同源性比較Tab. 1 Amino acid identities of GnRH-R of Chinese sturgeon and other fishes

圖1 基于鄰接法(a)和最大簡約法(b)構建的魚類GnRH-R的系統進化樹Fig. 1 Unrooted phylogenetic trees [Neighbour-joining (a) & Maximum parsimony (b) of the deduced amino acid sequence of GnRH-R of Chinese sturgeon and other fishes]

2.3 中華鱘GnRH-R基因的組織表達分析

在3-齡的雄性中華鱘中對GnRH-R基因的組織表達進行分析, 發現其在精巢中大量轉錄, 其精巢已發育至II期; 在肌肉和腦組織中可以檢測到微量的GnRH-R基因的mRNA; 而在心、肝、脾、腎及腸道等組織中幾乎無法檢測到其mRNA (圖2)。

3 討論

本研究通過基因同源克隆和RACE方法, 獲得了中華鱘GnRH-R基因cDNA全長序列, 這也是該基因序列首次在鱘形目魚類中的報道。中華鱘是一種原始的硬骨魚類。通過將其GnRH-R基因的氨基酸序列與其他已登記在NCBI上的魚類GnRH-R氨基酸序列進行序列比對后, 我們發現鮭形目, 鲇形目和鰻鱺目的物種, 其GnRH-R可以聚為一類, 而中華鱘與同屬古老硬骨魚類的矛尾魚一起, 與其他硬骨魚類可以聚為一類。這是否意味著硬骨魚類的GnRH-R在進化過程中有著2個不同的演化方向, 值得在今后的工作中進行更深入的探討。

本研究應用實時定量RT-PCR方法, 檢測其在3齡雄性中華鱘中的表達特征, 經檢測發現, 中華鱘GnRH-R基因在精巢中大量轉錄, 和我們之前的報道[18]相吻合的是, 其精巢已發育至II期, 暗示其在性腺發育特別是精子發生過程中可能起重要作用。但是其在腦組織的表達微弱, 而在其他硬骨魚類如斑紋隱小鳉[7]中, 其GnRH-R基因在腦組織和性腺中均有較高的mRNA的表達水平。在虹鱒[4]中, 該基因則在視網膜, 大腦, 卵巢中均有較高的mRNA的表達水平。由于中華鱘物種非常珍貴, 無法獲得新鮮的野生樣本, 而人工養殖的中華鱘也不易取材,所以本研究所用樣本數較少, 此結果還需進一步驗證。目前, 養殖中華鱘個體較野生的偏小、懷卵量少, 絕對繁殖力下降明顯; 性腺發育往往僅停留在Ⅱ期, 很難向Ⅲ期或者Ⅳ期過渡, 其性腺發育至Ⅲ期普遍需要10年以上時間。同時, 由于中華鱘的壽命長, 體型大, 相比較人工養殖的施氏鱘(初次性成熟年齡: 雌性: 9—11年; 雄性: 6—7年), 中華鱘初次性成熟年齡大(雌性: 14—26年; 雄性: 8—18年),產卵間隔期長(約2—7年)。因此, 急需縮短中華鱘的初次性成熟年齡和繁殖周期, 并提高懷卵量和繁殖力。GnRH與GnRH-R的主要作用是促進促性腺激素的釋放, 并促使性腺發育成熟, 但是其在中華鱘這一古老物種中的具體調控機制還有待于進一步的深入研究。本研究結果為中華鱘生長發育調控、GnRH-R基因結構與功能探討、魚類GnRHR進化奠定了基礎。

圖2 GnRH-R的mRNA在中華鱘各個組織中的表達差異Fig. 2 Relative expression of GnRH-R mRNA in heart, liver,spleen, kidney, testis, muscle, intestine and brain of Chinese sturgeon

[1]Tsutsumi M, Zhou W, Millar R,et al. Cloning and functional expression of a mousegonadotropin-releasing hormone receptor [J].Molecular Endocrinology, 1992, 6(7):1163—1169

[2]Reinhart J, Mertz L, Catt K. Molecular cloning and expression of cDNA encoding the murine gonadotropin-releasing hormone receptor [J].Journal of Biological Chemistry, 1992, 267(30): 21281—21284

[3]Moncaut N, Somoza G, Power D,et al. Five gonadotropin-releasing hormone receptors in a teleost fish: isolation,tissue distribution and phylogenetic relationships [J].Molecular Endocrinology, 2005, 34(3): 767—779

[4]Madigou T, Ma?anos-Sanchez E, Hulshof S,et al. Cloning, tissue distribution, and central expression of the gonadotropin-releasing hormone receptor in the rainbow trout(Oncorhynchus mykiss) [J].Biology of Reproduction,2000, 63(6): 1857—1866

[5]Robison R, White R, Illing N,et al. Gonadotropin-releasing hormone receptor in the teleostHaplochromis burtoni: structure, location, and function [J].Endocrinology,2001, 142(5): 1737—1743

[6]Okuzawa K, Tensen C, Bogerd J,et al. Molecular Cloning of a Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor cDNA from the Red Sea Bream,Pagrus major[J].Annals of the New York Academy of Sciences, 1998, 839(1):518—519

[7]Rhee J, Seo J, Raisuddin S,et al. Gonadotropin-releasing hormone receptor (GnRHR) gene expression is differently modulated in gender types of the hermaphroditic fishKryptolebias marmoratusby endocrine disrupting chemicals [J].Comparative Biochemistry and Physiology Part C:Toxicology & Pharmacology, 2008, 147(3):357—365

[8]Okubo K, Suetake H, Usami T,et al. Molecular cloning and tissue-specific expression of a gonadotropin-releasing hormone receptor in the Japanese eel [J].General and Comparative Endocrinology, 2000, 119(2): 181—192

[9]González-Martínez D, Madigou T, Ma?anos E,et al.Cloning and expression of gonadotropin-releasing hormone receptor in the brain and pituitary of the European sea bass: an in situ hybridization study [J].Biology of reproduction, 2004, 70(5): 1380—1391

[10]Tensen C, Okuzawa K, Blomenrohr M,et al. Distinct efficacies for two endogenous ligands on a single cognate gonadoliberin receptor [J].European Journal of Bioche-mistry, 1997, 243(1-2): 134—140

[11]Zhang H, Wei Q W, Kyanrd B,et al. Spatial structure and bottom characteristics of the only remaining spawning area of Chinese sturgeon in the Yangtze River [J].Journal of Applied Ichthyology, 2011, 27(2): 251—256

[12]Tao J P, Qiao Y, Yang Z,et al. Estimation on the spawning population and spawning sizes of Chinese sturgeon(Acipenser sinensis) and trend analysis of their change in recent years [J].Journal of Hydroecology, 2009, 30(2):37—43 [陶江平, 喬曄, 楊志, 等. 葛洲壩產卵場中華鱘繁殖群體數量與繁殖規模估算及其變動趨勢分析. 水生態學雜志, 2009, 30(2): 37—43]

[13]Shao K, Shi F, Yan S X,et al. Allele variation of a microsatellite locus AciG-35 in individuals of wild Chinese sturgeon [J].Journal of Hydroecology, 2014, 35(1): 1—6[邵科, 史方, 閆書祥, 等. 微衛星位點AciG-35在中華鱘野生個體中不同等位基因的序列變異研究. 水生態學雜志, 2014, 35(1): 1—6]

[14]Zhang X Y, Du H, Wei Q W,et al. The post-spawned recovery of cultured Chinese sturgeonAcipenser sinensis[J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2015, 39(4): 705—713[張曉雁, 杜浩, 危起偉, 等. 養殖中華鱘的產后康復. 水生生物學報, 2015, 39(4): 705—713]

[15]Chai Y, Gong J L, Du H,et al. Quality comparison of gamete of F1-generation and analysis of growth characteristics of F2-generation of Chinese sturgeon (Acipenser sinensis) [J].Journal of Fisheries of China, 2014, 38(3):350—355 [柴毅, 龔進玲, 杜浩, 等. 中華鱘子一代配子質量及其子二代生長特征分析. 水產學報, 2014, 38(3):350—355]

[16]Guo B F, Chang J B, Xiao H,et al. The reproductive biology of first filial generation ofAcipenser Sinensisgrowing up in the freshwater environment [J].Acta Hydrobiologica Sinica, 2011, 35(6): 940—945 [郭柏福, 常劍波,肖慧, 等. 中華鱘初次全人工繁殖的特性研究. 水生生物學報, 2011, 35(6): 940—945]

[17]Cao H, Li C J, Wei Q W,et al. cDNA clone and sequence analysis of proopiomelanocortin in Chinese sturgeonAcipenser sinensis[J].Acta Hydrobiologica Sinica,2011, 35(5): 776—782 [曹宏, 李創舉, 危起偉, 等. 中華鱘阿黑皮素原cDNA序列克隆及其序列分析. 水生生物學報, 2011, 35(5): 776—782]

[18]Leng X Q, Du H J, Li C J,et al. Molecular characterization and expression pattern ofdmrt1in the immature Chinese sturgeonAcipenser sinensis[J].Journal of Fish Biology, 2016, 88(2): 567—579