自己動手制造顯微鏡的人

編譯 陳軼翔

在費城賓夕法尼亞大學攻讀生物工程博士學位時，韋斯利·勒戈特（Wesley Legant）遇到了一個令人沮喪的障礙：他有自己的研究想法，但能夠將想法付諸實施的設備卻尚未出現。

由于對細胞力學和細胞運動很感興趣，勒戈特開始研發工具來測量細胞對環境的作用力。他在一個哺乳動物的增殖細胞周圍的物質中嵌入了熒光微球，這樣一來，當細胞移動時，其周圍物質就會變形，從而推動熒光微球移動。通過測量熒光微球的移動距離，勒戈特就可以計算出細胞施加的作用力。然而，他很難獲得準確的數據。

細胞依靠自身能量緩慢移動——速度最快為每分鐘幾微米——因此，需要在很長一段時間里用顯微鏡觀察這一細胞運動。為了跟蹤記錄三維立體的熒光微珠，勒戈特必須使整個系統在高空間分辨率下成像。那是在2010年左右，當時可用的商業顯微鏡——采用點掃描、渦流盤技術的共聚焦顯微鏡——無法完成上述工作。

比如有一個透明立方體。共聚焦顯微鏡可以讓科學家一個一個地捕捉到立方體中的每一個點，并逐漸形成一個三維影像。為此，共聚焦顯微鏡在樣本中垂直地投射一束光，但是每一束光都會產生破壞樣本的活性氧——也就是勒戈特所說的“光毒性”效應。與此同時，顯微鏡檢測到的發光“熒光團”會隨著時間的推移而逐漸消失——一種叫做光漂白的過程。

在勒戈特的實驗中，每一幅三維影像大約需要1分鐘的時間來獲取。然后他又要再等5分鐘——使細胞得以恢復，才能獲取下一幅影像，這樣才能在收集到所需數據之前使細胞避免由于光毒性而“逐漸消失”。勒戈特能夠測量細胞所產生的作用力，但實驗結果無法達到他想要的詳細程度。

為解決上述問題，勒戈特在其博士后研究中改變了研究方向。在弗吉尼亞州阿什伯恩市的霍華德·休斯醫學研究所的珍妮莉婭法姆研究學院，勒戈特與物理學家兼顯微鏡專家埃里克·白茲格（Eric Betzig）一起工作，他還加入了一個規模雖小但正在不斷發展壯大的自己動手制造（DIY）顯微鏡的社團。

成像技術

制造顯微鏡是一項復雜而耗時的挑戰，它需要一個擁有恰當技能組合的團隊，來處理其中所涉及到的各種光束陣列、機械及計算機部件。

在珍妮莉婭法姆研究學院，研究人員突破了神經科學和發育生物學的界限。這些領域很大程度上依賴于顯微鏡和成像技術，而該研究學院擁有大量現成的商用顯微鏡。但是當這些顯微鏡無法滿足研究需求時，研究者并不是在等待著新型顯微鏡的發明——而是自己動手去制造。

珍妮莉婭法姆研究學院的一位物理學家菲利普·科勒（Philipp Keller）表示：“在科技發展中我們的工作動力是希望有一天能夠實現現有顯微鏡無法進行的新型實驗。”

定制顯微鏡，如圖所示的等尺寸比例顯示光片照明顯微鏡，使研究人員能夠突破商業顯微鏡的限制

2005年左右，在德國海德堡的歐洲分子生物學實驗室工作時，科勒遇到了一個和勒戈特類似的問題：他想要跟蹤一個發育中的斑馬魚胚胎的所有細胞，以了解它們是如何移動、合并形成不同的組織和器官的。但是當時使用的大多數顯微鏡，由于強烈的光照需要，都無法使這樣大小的一個樣本持續長時間成像——直徑大約700微米的一團細胞。

于是，科勒轉向了光片照明顯微鏡，這是當時剛開始使用的一種技術。光片照明顯微鏡不是照亮整個樣本，而是將弱聚焦、低強度的光片直接投射到用戶想要成像的物體的焦平面上。高品質相機可以在一次曝光中捕捉到整個焦平面，通過在樣本中垂直移動平面，研究人員可以重現整個三維影像的物體。

科勒說：“光片照明顯微鏡是一種非常快速的成像技術，但同時也很溫和。那些離焦的結構不會因暴露于光線中遭到破壞。”當時，沒有現成的顯微鏡適用于科勒的研究，因此他在2005年決定自己制造一個。他設計的顯微鏡被稱為數字掃描激光光片熒光顯微鏡（DSLM），可以在90秒內捕捉到一個正在發育的斑馬魚胚胎中的每一個細胞。

并不是所有自己動手制造顯微鏡的人在開始設計時都有一個具體的研究問題。對于德國哥廷根馬克斯·普朗克生物物理化學研究所的物理學家斯蒂芬·黑爾（Stefan Hell）來說，提出關于顯微鏡技術的新概念本身就是一個目標。他說：“這是一項科學研究。我這樣做的目的是為了促進顯微鏡技術的發展。”

他在這方面取得了巨大的成功。2014年，黑爾與加州斯坦福大學的威廉姆·莫爾納爾（William Moerner），以及白茲格共同獲得了諾貝爾化學獎——他們發明了超高分辨率熒光顯微技術，使研究人員能夠在納米尺度上使生物結構成像。

黑爾認為，盡管自己構建的一些顯微鏡設計已經商業化了，但生物學家一般不需要效仿，因為制造商會十分迅速地將新的構建想法投入生產。他自己的諾貝爾獎獲獎設計，被稱為“受激發射損耗”，或者STED，始建于1999年耗資20萬美元。現在，它已經簡化為一個按鈕操作系統，其大小是鞋盒的一半，可以附著在任何現有的共聚焦熒光顯微鏡上。黑爾表示，還有幾家公司也在制造光片照明顯微鏡。

研究人員可以將定制設計，比如OpenSPIM.org網站上的設計，應用到不同的配置中

然而，科勒認為，光片照明顯微鏡的技術領域仍然相對不成熟，而且少數幾個已經商業化的系統要達到科學研究的前沿需求，還需要7到8年的時間。他說：“實際上，我們是不得不自己動手去建造所需的新型顯微鏡。”

這個過程必然是有利有弊的。定制系統在速度和分辨率方面是遙遙領先的，并且可以為特定的生物問題或系統而定制。但這是以靈活性為代價的。在一些自己動手制作的系統中，一些簡單的事情做起來也并非易事。定制系統需要大量的時間和精力來構建和維護。

馬里蘭州貝塞斯達市的美國國家心肺血液研究所的一名細胞生物學家，克萊爾·沃特曼（Clare Waterman）表示，對于那些愿意接受挑戰的人來說，回報是值得的。在20世紀90年代初，沃特曼利用新攝像技術開發了一種名為熒光斑點成像的技術，該技術可以用于研究細胞骨架和其它大型的多蛋白質復合體。

DIY顯微鏡指南

無論是為了促進顯微技術發展還是為了解決一個特定的生物學問題，構建新型顯微鏡的過程基本上都是一樣的。科勒在這方面經驗豐富，他說：“我們會長期研究、構建新型顯微鏡。”他把這個構建過程簡要地進行了總結（見下文“DIY顯微鏡的十個步驟”）。科勒表示，一個優秀的顯微鏡構建團隊應該需要一個物理學家或生物醫學工程師來管理這個項目，同時需要至少4位專業人士的支持：一位光學工程師進行光路設計；一位機械工程師研究如何將零部件組裝在一起；一位軟件開發者對機器進行編程；一位計算機工程師將原始數據轉換成可用影像。

DIY顯微鏡的十個步驟

建造顯微鏡是一個復雜的過程，不過，菲利普·科勒將這一過程精煉為十個步驟：

1 集思廣益，對要設計的新型顯微鏡進行研究討論

2 計劃并檢測光路設計

3 利用計算機輔助設計軟件來設計主體和定制的部件

4 訂購零件，制造定制的機械和光學部件

5 借用組件來檢測它們的性能和集成度

6 組裝一個原型

7 編寫顯微鏡控制軟件

8 根據性能改進定制部件

9 進行原理論證實驗

10 研發并改進圖像處理軟件

第一步是光路設計。利用專業軟件——科勒和勒戈特使用的是華盛頓柯克蘭的Zemax公司提供的軟件“視覺工作室”——光學工程師在虛擬空間中工作，確定激光器、透鏡、反光鏡和其他光學元件的正確排列，以達到所需的分辨率，并滿足相應的特性。

然后，機械工程師需要研究所有這些部件在現實世界中應如何組裝在一起，就像將物理部件固定在一個光學臺上一樣。在珍妮莉婭法姆研究學院和科勒一起工作的布賴恩·庫柏（Brian Coop）說：“此時，它只是排成一行的一束透鏡，還漂浮在空中。我的任務就是要讓它獨自站立起來。”

庫柏認為，這一階段最大的挑戰是要在極其嚴格的物理約束條件下工作。當顯微鏡必須聚焦于只有幾微米甚至是幾納米大小的物體時，幾乎不容有任何差錯。透鏡、反光鏡和激光器需要精確定位，才能產生有用的、焦距內的圖像，而庫柏需要考慮到，諸如金屬熱膨脹等微小的變化，可能會使它們發生偏離。庫柏說：“注意光學校準的精度會使得一切后續工作都變得簡單。”

庫柏盡可能用現成的零部件來制造顯微鏡。但每臺顯微鏡都需要一些定制的部件，因此庫柏必須自己設計，有時會在珍妮莉婭法姆研究學院的機械車間里自己制造。

一旦光學工程師和機械工程師組裝了一個原型之后，軟件開發者和計算機工程師就會投入工作，以確保各部件能夠協調、正常運作并產生有用的圖像。珍妮莉婭法姆研究學院的一名計算機程序員丹尼爾·米爾琪（Daniel Milkie）表示，許多顯微鏡構造者使用一個叫做LabVIEW的商業程序包來控制他們的顯微鏡，但是當機器變得更高級時，有時需要一個定制的解決方案。

米爾琪說：“我們正在設計新的工具和新型顯微鏡來提高硬件可達到的極限，所以需要設計專門的軟件以達到最佳性能。”關鍵是要確保軟件足夠靈活，能夠快速調整以滿足新的需求，比如數量更多的探測器。因此，米爾琪使代碼模塊化，這意味著不必從頭開始就可以很容易集成新的元件。

但是，米爾琪說，軟件方面最大的挑戰是如何處理顯微鏡產生的大量數據。高速攝像機每秒能產生十億字節的數據，而一些顯微鏡可能有幾個攝像頭在同時運行。米爾琪表示，僅白茲格實驗室每年就可以產生50 ～100兆兆字節的數據。他說：“我們已經創建了這個數據流，那么它將流向哪里呢?”

成品看起來和傳統的顯微鏡沒什么不同。所有的部件——反光鏡、透鏡、激光器、攝像頭和樣品腔——都被連接到一個重達幾噸的桌子上的各種柱子和夾子上，并經過設計以使顯微鏡免受震動。勒戈特表示，這就像一套精心設計的樂高玩具。

科勒估計，從零開始制造一臺顯微鏡至少需要一年的時間，但如果團隊能夠從早期的設備中回收零部件和軟件，就可以減少所需時間。而且由于定制需要越來越高級，使得研發所需的費用變得越來越多。科勒于2005年設計的數字掃描激光光片熒光顯微鏡（DSLM）花費了大約5萬美元，而后來設計的顯微鏡花費則高達10萬～ 20萬美元。他于2015年設計的最新版本——各向同性多視圖顯微鏡——花費在100萬美元以上。科勒說：“我認為，如今一個只花費5萬美元就設計制造出來的顯微鏡不能說是對現有技術的改進。”

關于定制的問題

定制顯微鏡也需要使用更多的技巧，因為每個實驗通常都需要進行大量的設置和校準——用戶親自動手的那種調整——商業制造商通常不會這么做的。但沃特曼認為，這不應該是一個障礙。她說：“這是顯微鏡基礎課程中應該學的基本技能。”

涉及新型顯微鏡系統的已發表研究中通常包括設計方案和零部件清單。對于那些想要了解相關技能的人，可以從網絡上獲取珍妮莉婭法姆研究學院有關顯微鏡的設計方案和軟件，該學院還為顯微鏡的構建過程提供幫助。勒戈特說：“有大約20個小時的視頻教程講解如何組裝并調準所有的零部件。”此外，還有其它可以獲得專業技能的渠道。例如，馬里蘭州貝塞斯達的美國國家生物醫學成像和生物工程研究所的高分辨率光學成像部的一位生物物理學家哈里·什羅夫（Hari Shroff）開創的diSPIM.org網站；德國德勒斯登的馬克斯·普朗克分子細胞生物學與遺傳學研究所的帕維爾托曼卡克發育生物學實驗室創立的OpenSPIM.org網站；西班牙巴塞羅那市光子科學研究所的埃米利奧·瓜爾達（Emilio Gualda）負責的OpenSpinMicroscopy網站等。這些網站都免費提供各種光片照明顯微鏡的配置指導。

但是，盡管按照現有的計劃去構建一個顯微鏡比從頭開始設計一個要簡單得多，但仍然需要光學、機械學、電子學、計算機編程和生物學方面的知識。瓜爾達說，最大的優勢是價格。由OpenSpinMicroscopy網站提供的選擇性平面照明顯微鏡的商業版售價約為20萬美元。據瓜爾達估計，使用他的開源軟件和像Arduino控制器這樣的經濟型硬件，研究人員可以制造出一種高級顯微鏡，而費用只需要大約5萬美金，其中大部分花費在激光器和攝像頭上。瓜爾達補充道：“你可以根據自己的具體需要去定制顯微鏡。”

用戶還可以從一些線論壇上得到建議和技巧。馬薩諸塞州波士頓的哈佛醫學院的一位分子生物學家，蘇里古庫·烏帕迪亞尤拉（Srigokul Upadhyayula）曾于2014年在珍妮莉婭法姆研究學院與勒戈特一起構建了首臺晶格層光顯微鏡，他認為，這種合作表示這些科學家的工作方式發生了巨大變化。他說：“這樣的合作在該領域是很少見的，因為在過去每個人都曾是孤立的。”

勒戈特目前正準備在北卡羅來納大學教堂山分校建立自己的實驗室。這將使他能夠繼續進行細胞生物學和顯微鏡設計方面的工作。他的首批項目之一將是重新探討細胞如何移動的問題。他說：“我們已經用自己的最新系統解決了技術問題——只是還沒有機會把它應用到那個特定的問題上。”現在，勒戈特已經設計出了做這項工作所需的工具，或許最終會得到他多年來一直在追尋的答案。