豬鏈球菌熒光定量PCR檢測方法的建立及臨床應用分析

（北京納百生物科技有限公司，北京 100176）

豬鏈球菌為對公共衛生安全構成嚴重威脅一種典型人獸共患病原菌，可引發支氣管肺炎、豬腦膜炎、敗血癥等多種疾病，如何防控是相關部門研究的重點。在對豬鏈球菌進行檢測時，生化鑒定、細菌培養均為常用手段，但除檢測用時較長外，且極易出現漏診或誤診事件，準確度居較低水平[1]。而熒光定量（PCR）特異性、靈敏性均較理想，可有效規避上述檢測方式的不足，為疾病控制提供有力參考依據。本次研究以此展開探討，現結果如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

（1）儀器與試劑：DU640型核酸蛋白儀、PCR儀均購自美國ABI公司；Premix Ex TaqTM試劑盒由Takara公司提供。（2）菌株：豬生活區域分布的常見菌群，包括丹毒桿菌、豬副溶血嗜血桿菌、豬布魯氏菌等；豬鏈球菌。

1.2 探針序列

參考豬鏈球菌在GenBank中已呈登錄狀態的抗原基因序列，對基因保守區展開細致的分析；在Primer Express 3.0軟件中，對極具特異性的探針及引物設計，并經BLAST，初步鑒定其特異性，合成一對特異性引物和探針。

1.3 制備陽性標準品

含部分含有豬鏈球菌抗原基因的片端于PUC57質粒上構建，對重組克隆菌予以制備，以在后續的擴增實驗使用。對重組質料有效提取后，在紫外分光光度計輔助下，獲取OD260和OD280值及兩個數值比值，檢測3次，獲取平均值，對質粒DNA所反映的純度、濃度確定，準確計算拷貝數，按1×105拷貝/ μl稀釋，于-20℃條件下凍存備用。質粒具體的檢測濃度×6.02×1023與質粒總長度×600的比值為拷貝數。

1.4 樣品檢測及提取DNA

對15只疑似豬鏈球菌感染的豬扁桃體組織采集，于無菌條件下，精密稱取1g，在研缽中放置，取生理鹽水2.5ml加入，行研磨及充分混勻處理，取研磨液150μl，應用DNA提取試劑盒，有效完成對基因組DNA的提取工作，模板DNA的純度、濃度應用紫外分光光度計測定，DNA樣品獲取后，于-20℃條件下凍存備用。

1.5 建立熒光定量PCR體系

在PCR儀上完成PCR擴增反應，程序：設置溫度為42℃，用時為20min；設置溫度為95℃，用時為10min，設置溫度為94°C，用時為15s，設置溫度為55℃，用時30s，共有循環40個。依據此程序，以陽性質粒為實驗模板，分別優化退火溫度，即52℃～60℃；探針濃度，即2.5～7.5μmol/L；引物濃度，即5～10μmol/L。以2μmol/L對探針濃度做遞增處理，以2°C對退火溫度作遞增處理，對PCR反應條件予以優化。

1.6 檢測靈敏性

將豬鏈球菌重組質粒向1×105拷貝/μl稀釋，再于10倍系列條件下，對5個梯度稀釋，模板為1×101-1×104拷貝/μl，單個梯度安排3次操作，對其靈敏度進行測定。1.7 檢測特異性

應用優化后方法，對丹毒桿菌、豬鏈球菌、豬布魯氏菌、豬副溶血嗜血桿菌加以檢測，設置空白對照及陰陽性對照，以對特異性開展驗證。

1.8 臨床實驗

取15只疑似豬鏈球菌感染的病豬扁桃體組織總DNA，空白對照為ddH2O，陽性對照為豬鏈球菌重組質粒，陰性對照為健康豬相同組織總DNA，依據優化條件，完成FQ-PCR擴增操作，采用國標法復驗，以對符合率驗證。

1.9 統計學分析

涉及數據均輸入spss13.0，組間計數資料采用（%）表示，行x2檢驗，P<0.05具統計學差異。

2 結果

PCR檢測擴增曲線呈S型、Ct值<35為陽性，應用所建立的FQPCR法對靈敏度進行檢測，最低限度為1×102拷貝/μl的重組質粒；特異性檢測表明，僅豬鏈球菌樣本有的擴增曲線，其他非目的模板均無擴增曲線；應用此種方法，檢測15份疑似豬鏈球菌感染組織樣本，陽性共14份，相較國標法檢測，有更高符合率。見表1。

3 討論

本次研究通過FQ-PCR方法的建立，進行豬鏈球菌熒光定量檢測，取得了理想成效。同普通PCR相比，熒光定量PCR技術具有便捷、快速、敏感特異性高等特點，已在畜禽疫病診斷中得到廣泛應用。此次采取探針與引物結合的方法，表現出了較高特異性，采用此方法檢測其他細菌，僅豬鏈球菌有擴增曲線表現出，對其靈敏性進一步證實，能檢測到1×102拷貝/μl的重組質粒，提示敏感性較理想[2]。應用此方法對15份疑似豬鏈球菌感染的組織檢測，結果與細菌鑒定一致，且陽性率優于細菌鑒定，有較為理想的應用成效。

綜上，針對豬鏈球菌，采用熒光PCR檢測，有較高靈敏度及特異性，符合率居更高水平。

[1]李建達，于江，張玉玉，等.豬鏈球菌2型實時熒光定量PCR檢測方法的建立與應用[J].中國畜牧獸醫，2016，43（12）：3107-3133.

[2]王蓉蓉，孫衛東，蔣蔚，等.豬鏈球菌2型主要毒力因子三重熒光定量PCR檢測方法的建立[J].中國動物傳染病學報，2014，22（6）：25-31.