食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

（南京市畜牧獸醫(yī)站，江蘇南京 210012）

食源性疾病的預(yù)防與控制已引起了世界各國(guó)關(guān)注。食源性疾病病原的檢測(cè)技術(shù)是食源性疾病的預(yù)防與控制的關(guān)鍵的技術(shù)環(huán)節(jié)。大腸桿菌、沙門氏菌等細(xì)菌是常見(jiàn)污染食品的致病菌。目前這些食源性致病菌是我國(guó)進(jìn)出口食品的主要檢測(cè)項(xiàng)目。微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的方法固然是最穩(wěn)定最成熟的方法，但因其復(fù)雜費(fèi)時(shí)，有時(shí)不能適應(yīng)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處理快速反應(yīng)的需要。隨著時(shí)代的進(jìn)步，檢測(cè)方法的先進(jìn)性、靈敏度、特異性要求都更高。特別是一些新的病原菌食源性疾病的發(fā)生，對(duì)檢測(cè)技術(shù)提出更高的要求。為此，人們?cè)趥鹘y(tǒng)的鑒定方法的基礎(chǔ)上，不斷地嘗試研制和改進(jìn)檢測(cè)設(shè)備，研究和創(chuàng)新檢測(cè)技術(shù)，以求快速準(zhǔn)確地檢測(cè)食品中的微生物含量。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，為微生物快速檢測(cè)提供了良好的技術(shù)平臺(tái)。現(xiàn)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)的食源性病原菌的檢測(cè)方法，對(duì)食源性致病菌最新檢測(cè)技術(shù)及其研究進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)述。

1 國(guó)內(nèi)外食源性致病菌檢測(cè)現(xiàn)狀

目前已有許多國(guó)內(nèi)和國(guó)際組織可以對(duì)食品檢測(cè)方法進(jìn)行認(rèn)證。在美國(guó)，主要機(jī)構(gòu)是 AOAC（美國(guó)官方分析化學(xué)師協(xié)會(huì)），通過(guò) AOAC 認(rèn)證的方法一般都被視為是“權(quán)威或標(biāo)準(zhǔn)”的方法。國(guó)內(nèi)食品微生物檢測(cè)主要執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)通常采用國(guó)標(biāo)中的檢測(cè)方法流程，并有相應(yīng)的規(guī)定，菌落總數(shù)（包括霉菌酵母菌）和大腸菌群限量標(biāo)準(zhǔn)只規(guī)定最大限量，致病菌規(guī)定“不得檢出”。隨著食品等工業(yè)和醫(yī)學(xué)診斷等對(duì)微生物的控制和檢驗(yàn)要求越來(lái)越嚴(yán)格，近年來(lái)也出現(xiàn)了不少快速檢測(cè)的方法及相應(yīng)的自動(dòng)化儀器。

2 食源性致病菌檢測(cè)方法簡(jiǎn)介

2.1 傳統(tǒng)的微生物學(xué)檢測(cè)方法

主要是按照現(xiàn)行國(guó)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)，最傳統(tǒng)，最經(jīng)典，但步驟煩瑣，最麻煩，檢測(cè)周期較長(zhǎng)，但是可作為其他方法的驗(yàn)證。

2.2 顯色培養(yǎng)基方法

在培養(yǎng)基中分別加入某種特定的無(wú)色合成底物，經(jīng)微生物特異性酶的作用而釋放出色原，呈各種顏色或熒光。大多數(shù)顯色培養(yǎng)基只需在樣品增菌后，分離培養(yǎng)18～24h，即可根據(jù)菌落的顏色做出初步的鑒定。結(jié)果直觀，一目了然。靈敏度高、特異性強(qiáng)，大大減少了后續(xù)的鑒定步驟。但存在一定的假陽(yáng)性和假陰性，比如97%的大腸埃希氏菌含有β-葡萄糖苷酶，約10%的沙門氏菌屬中也含有此酶；不是所有具有特征性酶的微生物均在含底物的培養(yǎng)基中顯示陽(yáng)性反應(yīng)。

2.3 免疫膠體金技術(shù)

是以膠體金作為標(biāo)記物結(jié)合免疫原理的一種應(yīng)用于抗原抗體的新型技術(shù)，該技術(shù)運(yùn)用最廣泛的就是斑點(diǎn)免疫金滲濾法（DIGFA）。鄢雷娜等[1]都利用此技術(shù)對(duì)沙門氏菌的快速檢測(cè)進(jìn)行了研究，利用斑點(diǎn)免疫金滲濾法對(duì)沙門氏菌抗原進(jìn)行了研究，結(jié)果表明此法簡(jiǎn)單、快速，適合推廣運(yùn)用；通過(guò)建立直接檢測(cè)沙門氏菌的斑點(diǎn)免疫金滲濾法檢測(cè)試紙盒對(duì)該菌進(jìn)行了研究。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)

簡(jiǎn)稱 ELISA技術(shù)，此技術(shù)敏感性高，不需特殊設(shè)備，結(jié)果觀察簡(jiǎn)便。它是把抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合的一種檢測(cè)技術(shù)，既可以測(cè)抗原，也可以測(cè)抗體。早在1977年就有報(bào)道將酶聯(lián)免疫吸附法用于食品中沙門氏菌的檢測(cè)[2]，設(shè)計(jì)捕獲抗體和檢測(cè)抗體，建立快速檢測(cè)沙門氏菌雙抗夾心ELISA方法對(duì)食品中的沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)。建立雙抗夾心ELISA體系，檢測(cè)模擬污染肉樣中沙門氏菌，其檢測(cè)限為800CFU/g，結(jié)果顯示與其他血清型沙門氏菌、單增李斯特菌等菌均無(wú)交叉反應(yīng)，特異性良好。

2.5 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

PCR技術(shù)是一項(xiàng)敏感性高、特異性強(qiáng)且快速準(zhǔn)確的微生物檢測(cè)技術(shù)，也被許多學(xué)者用于對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)和研究。邱楊等[3]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法、BAX（r）方法和PCR 方法 3 種方法對(duì)沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)。在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上建立了檢測(cè)沙門氏菌的新的PCR方法—多重PCR。此外其他新的PCR技術(shù)也運(yùn)用于沙門氏菌的檢測(cè)，通過(guò)對(duì)熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的摸索，建立了檢測(cè)沙門氏菌的核酸熒光定量PCR方法，此研究為沙門氏菌快速檢測(cè)試劑盒的研制打下了良好的基礎(chǔ)。

2.6 磁性納米材料檢測(cè)技術(shù)

主要是經(jīng)過(guò)生物學(xué)修飾和功能化的磁性納米材料，特異性地識(shí)別基質(zhì)中少量的致病菌，并通過(guò)磁場(chǎng)對(duì)靶細(xì)菌進(jìn)行快速及高特異性的選擇性分離，實(shí)現(xiàn)樣品中少量致病菌的特異性分離富集，達(dá)到后續(xù)分析檢測(cè)的純度和數(shù)量。

2.7 核酸探針技術(shù)

一種利用探針編碼檢測(cè)食源性致病菌的方法，它是通過(guò)單一反應(yīng)對(duì)多個(gè)食源性致病菌進(jìn)行鑒定的實(shí)時(shí)PCR方法。是根據(jù)核苷酸堿基互補(bǔ)的原理，在已變異的DNA樣品中加入用同位素等標(biāo)記的DNA特異片段，在一定條件下兩片段進(jìn)行雜交從而達(dá)到檢測(cè)DNA的目的。在四色實(shí)時(shí)PCR儀上可實(shí)現(xiàn)對(duì)15種模板的基因分型的食源性致病菌的檢測(cè)方法。將培養(yǎng)后的菌株標(biāo)本提取DNA；通用引物的設(shè)計(jì)及PCR產(chǎn)物的測(cè)序；設(shè)計(jì)熒光雙鏈置換探針；設(shè)計(jì)多色探針編碼體系；變溫雜交反應(yīng)；構(gòu)建單重實(shí)時(shí)PCR體系；構(gòu)建多重多色實(shí)時(shí)PCR體系；驗(yàn)證多重多色實(shí)時(shí)PCR體系。此技術(shù)不僅簡(jiǎn)便、快速而且敏感性高、特異性強(qiáng)，已用于食品中沙門氏菌的檢測(cè)。李少彤等[4]通過(guò)建立一種新穎的肽核酸探針結(jié)合熒光原位雜交方法對(duì)血液、糞便、水以及嬰兒奶粉樣品中沙門氏菌進(jìn)行了檢測(cè)，準(zhǔn)確度高達(dá) 100%。

2.8 ATP生物熒光法

所有的生物體中都含有能夠傳達(dá)能量的ATP，檢驗(yàn)ATP就可知道細(xì)菌數(shù)量及活性。微生物中含ATP量很少，如在熒光素酶、熒光物質(zhì)與氧及鎂離子存在的條件下，其光量與樣品中ATP量成正比，憑此光量來(lái)檢驗(yàn)微生物含量。

2.9 乳膠凝集（LA）技術(shù)

是一種最簡(jiǎn)單的抗體檢測(cè)方法。在乳膠凝集實(shí)驗(yàn)中，采用包被有抗體的彩色乳膠顆粒當(dāng)與目標(biāo)菌菌懸液混合后，如果懸液中有特異性抗原存在，就可以形成肉眼可見(jiàn)的凝集或沉淀。凝集反應(yīng)簡(jiǎn)便迅速，但靈敏度不高，反應(yīng)約需要107CFU。即便如此，它的靈敏度也比傳統(tǒng)的血凝或細(xì)胞凝集試驗(yàn)提高了10～100倍[5]。

2.10 噬菌體裂解技術(shù)

噬菌體有特異性裂解細(xì)菌的作用。利用此技術(shù)進(jìn)行沙門氏菌快速檢測(cè)，李萌等[6]利用噬菌體裂解對(duì)150份樣品進(jìn)行快速檢測(cè)，結(jié)果說(shuō)明腸桿菌科噬菌體組合對(duì)培養(yǎng)10h的沙門氏菌敏感性和特異性較高，這對(duì)實(shí)現(xiàn)沙門氏菌實(shí)時(shí)、快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)有重要意義。

2.11 生物傳感器技術(shù)

生物傳感器是一種小型、便攜的分析裝置，由固定化并具有化學(xué)分子識(shí)別功能的生物材料、換能器件及信號(hào)放大裝置構(gòu)成。其工作原理是待測(cè)物質(zhì)與生物活性材料發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生的信號(hào)由換能器轉(zhuǎn)換成可定量和可處理的電信號(hào)，經(jīng)二次儀表放大輸出，最終獲得待測(cè)物濃度的信息。生物傳感器按識(shí)別元件可分為酶?jìng)鞲衅鳌⑽⑸飩鞲衅鳌⒔M織傳感器、細(xì)胞器傳感器、免疫傳感器等。DNA生物傳感器的識(shí)別元件為核酸探針，因其便于與PCR技術(shù)結(jié)合而逐漸成為研發(fā)熱點(diǎn)。生物傳感器技術(shù)具有靈敏度高、特異性好、樣品前處理簡(jiǎn)單、響應(yīng)和檢測(cè)迅速、操作簡(jiǎn)單、攜帶方便、可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)。

3 小結(jié)

綜上所述，食源性致病菌檢驗(yàn)技術(shù)正從傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法向分子檢測(cè)方法改進(jìn)，并向儀器化、標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化方向發(fā)展。隨著微生物檢測(cè)技術(shù)的日漸成熟，目前形成了集傳統(tǒng)檢測(cè)方法，快速檢測(cè)方法，以及大型儀器檢測(cè)于一體的檢測(cè)體系。伴隨著人們對(duì)食品安全以及人類健康等生活環(huán)境要求越來(lái)越高，在未來(lái)發(fā)展過(guò)程中需要我們不斷改進(jìn)和創(chuàng)新，建立更成熟可靠、方便快捷的食源性致病菌快速檢測(cè)技術(shù)。

[1]鄢雷娜，羅躍華，劉緒平，等.乳制品中常見(jiàn)食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2017，8（1）：138-141.