內皮祖細胞促進皮瓣存活的研究進展

李苗鐘 梅 勁 王 欣 章偉文

(寧波大學醫學院附屬寧波市第六醫院，浙江 寧波 315211)

目前皮瓣移植術在解決缺損覆蓋、塑型重建等方面發揮著巨大的作用。近年來，隨著干細胞研究的不斷深入，基于干細胞介導的治療性血管生成重建血運逐漸得到重視。內皮祖細胞(EPCs)作為血管前體細胞，在介導血管重建和恢復血運方面發揮著重要的作用〔1,2〕。本文就近年來EPCs促進缺血皮瓣存活方面的研究進展做一回顧。

1 EPCs參與血運重建

EPCs可來源于外周血、骨髓、臍帶血、脾臟、胎腎、胎肺、血管壁及脂肪組織中〔3～5〕。個體在出生后的血管再生從血管形成發展到血管發生和血管生成。血管發生是由EPCs動員、遷移、增殖及分化，在原位形成原始毛細血管網，而血管生成是在原本存在的血管網基礎上，血管內皮細胞遷移、增殖并重塑，形成新的成熟血管。研究〔1，6～9〕顯示，EPCs促進血運重建的作用可用于血管新生、內皮再生、心血管病治療、缺血性部位的治療、腫瘤的治療、組織工程、基因治療等領域。

2 EPCs干預缺血皮瓣

2.1直接注射EPCs 血運障礙是皮瓣移植術后最常見的并發癥，嚴重者可大塊組織壞死或導致手術完全失敗，同時其他常見的并發癥還有：血腫，皮瓣撕脫和感染。這些并發癥的發生主要是由于靜脈回流不暢造成的。由于EPCs具有對缺血組織定向遷移的特性，不但可以歸巢聚集于心肌和缺血肢體，同樣也可以聚集于缺血的皮瓣，理論上應具有良好的治療效果。

研究表明，在一些針對缺血皮瓣模型的研究中，增加損傷部位EPCs的數量能加快局部組織的血運重建，促進皮瓣的存活〔10〕。骨髓源性或臍帶源性EPCs在近似圓形、正方形、長方形還是狹長形的隨意皮瓣研究中都能明顯加速皮瓣缺血、缺氧組織的血運重建，改善皮瓣缺血缺氧狀態，提高皮瓣存活面積及成活質量，提高皮瓣毛細血管網密度，增加血管引流，改善皮瓣淤血狀態，從而保持組織較好的彈性和色澤〔11〕。EPCs在血管生長因子的誘導下，分化組成新生血管中約占26%的內皮細胞〔12〕。EPCs能提高皮瓣存活面積，主要機制可能與其參與組成并促進微血管新生有關。皮下注射可促進形成局部新的微血管網，后者在皮瓣靜脈回流不暢、代謝物堆積、微循環系統進行性惡化時能提供低流量的血流，建立微循環系統，促進淤血組織的存活〔13〕。

2.2間接上調EPCs：生長因子 EPCs的動員、遷移、歸巢和增殖往往受多種生長因子、趨化因子、炎癥因子等因素的影響。堿性成纖維生長因子(bFGF)是維持EPCs表型的必需因子，缺乏時可影響后者形成管狀結構的能力〔14〕。并且還能通過激活磷脂酶C-γ和血小板生長因子-BB通路促進EPCs的遷移、增殖和分化〔15〕。有研究者〔16〕為研究EPCs對狹長窄蒂皮瓣模型的作用時，在皮下均勻注射重組人生長激素，觀察bFGF的表達和皮瓣的存活。結果表明注射重組人生長激素的大鼠皮瓣中bFGF表達及微血管數明顯增加，能間接通過EPCs的增殖促進微血管新生，改善局部缺血缺氧狀態，擴大皮瓣存活面積。同時還有一些研究人員通過基因轉染等方法研究EPCs和皮瓣存活之間關系。易成剛等〔17〕利用脂質體介導血管內皮細胞生長因子(VEGF)165基因體外轉染EPCs,并移植于裸鼠隨意皮瓣。觀察發現,體內EPCs數量有所增加,說明基因轉染后的EPCs在體內增殖分化能力較強,而且EPCs均整合入裸鼠的新生血管內膜中。說明表達的VEGF165蛋白有明顯的促進EPCs增殖的作用,同時VEGF可促使EPC 分化參與血管內膜的修復。實驗表明，無論是直接應用VEGF、重組人生長激素等生長因子或與之相關基因治療手段，促進EPCs內皮化，還是直接注射，增加EPCs的數量，都能加快血管形成和血運重建〔18〕。此外EPCs本身也可以分泌VEGF，基質細胞衍生因子(SDF)-1α等趨化因子，并且通過自分泌和旁分泌效應促進血管生成過程〔19〕，提高隨意皮瓣的存活率和存活面積、還能改善軸型皮瓣及游離皮瓣的遠端血運情況、減少帶蒂皮瓣斷蒂時間的影響〔20〕、縮短皮瓣內形成功能血管所需時間、加速擴張皮瓣擴張速度。

3 EPCs干預微血管病變

內皮細胞受到損傷和微循環出現障礙是微血管病變發生的基礎，糖尿病(DM)引起的DM足及DM潰瘍的始動因素正是內皮損傷。而EPCs可大量增殖分化為成熟的內皮細胞，修復內皮細胞并排列形成新的血管網，增加微血管的血流灌注。提示EPCs在治療微血管病變方面有潛在的應用前景。腎臟是一個富有血管的臟器之一，常常作為微血管病變的靶器官。Yuen等〔21〕將健康大鼠造成慢性腎損傷模型，即右腎切除，左腎結扎兩根腎動脈分支達到2/3腎梗死，假手術組做雙腎剖腹探查及術后傷口縫合處理。實驗動物給予健康大鼠來源的EPCs移植，結果顯示腎功能明顯恢復，腎小球濾過率(GFR)明顯提高，效果與血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)或血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)類似。此外，EPCs能還能減少慢性腎損傷大鼠尿蛋白含量，增加腎小球與間質的微血管密度，緩解腎小球硬化和小管間質的纖維化。后來有學者用DM小鼠來源的EPCs重復了上述研究，得到相似的結論，驗證了DM小鼠來源的EPCs同樣具有治療價值〔22〕。Zhang等〔23〕進一步探討證明了無論是給予來源于非DM還是DM小鼠來源的EPCs，移植到DM腎病小鼠體內后，均可減輕白蛋白尿的進展和系膜基質增生的程度。提示治療與微血管病相關的皮膚損害可以從改善微血管內皮功能著手。楊晨等〔24〕通過EPCs移植小鼠后肢單側缺血模型，發現經過細胞移植后缺血后肢的毛細血管密度，血流灌注及壞死程度相較對照組有明顯改善。彭艷等〔6〕也對DM大鼠下肢缺血造模，得到了類似的結論。Kim等〔7〕將EPCs移植到4例患有Buerger病的患者上，發現治療后他們的靜息痛很快緩解了，4 w后壞死的皮膚損傷也完全愈合了，血流動力學方面也有很大變化，遠端毛細血管的數量和管徑明顯提升，血管阻力明顯下降。EPCs在改善系統性疾病、創傷等引起的微血管病變和局部循環障礙中都能分化成內皮細胞，參與微血管新生、血運重建，修復微血管網等，從而延緩疾病進展，改善預后。

4 影響EPCs時作用發揮的因素

4.1EPCs的功能下調或數量減少 引起EPCs作用的發揮減弱的原因:①直接抑制了EPCs的生成或加快其凋亡；②細胞數量沒有變化，但是其功能有所下調。研究〔8〕發現高齡與缺血部位的血管重建能力降低有關，并且能導致心血管相關并發癥的高發和組織恢復能力的減弱〔9〕。有實驗表明高齡能下調EPCs的作用，并且其EPCs本身數量與年輕的大鼠相比并無顯著改變，經過進一步的研究發現這是和高齡大鼠體內缺乏缺氧誘導因子(HIF)-1α穩定劑有關，通過對高齡大鼠補充鐵鰲合劑去鐵胺就能夠逆轉這一作用，從而增加血流、改善缺血部位的血運情況〔25〕。

相反，在高血糖的狀態下，EPCs的敏感性被增強了，但是其數量和增殖能力大大減少了，總體的作用表現為減弱〔26〕。在以高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)相對缺乏的高脂血癥的患者中EPC的數量和功能都表現為下調，然而EPCs在HDL-C正常的高脂血癥患者中的數量和功能并未受到影響〔27〕。血管內皮依賴性舒張素(EDV)在心血管防治中起著重要作用〔28〕，并且被證實為是EPCs的保護因素〔29〕。而EPCs在HDL-C正常的高脂血癥患者能維持正常的功能和數量，正是后者對EDV的保護作用。所以HDL-C是影響高脂血癥患者體內EPCs作用的主要決定因素。除此之外，此類患者的EPCs還與C反應蛋白(CRP)、活性氧(ROS)、酶的表達活性有關。吸煙能夠增加CRP、ROS的反應，減少HDL-C、HDL-C，降低酶的活性。因此吸煙等引起長期慢性血管損傷、氧化應激、HMG-coA還原酶增加的因素都是引起缺血時降低EPC作用的危險因素〔30〕。

進一步的研究發現,蛋白激酶B(Akt)在缺血部位EPCs發揮血管重建的過程中起著中心環節的作用。研究人員〔31〕對轉染Akt基因和沉默該基因的對比研究發現，沉默組的EPCs募集和重建血管能力大大減弱，而轉染組比正常對照組的能力還要增強。并且凋亡蛋白Bim能使得EPCs凋亡，而叉頭轉錄因子(FOXO)4能促進Bim的上調，Akt的磷酸化能引起FOXO4的磷酸化，從而抑制EPCs的凋亡，增加募集和重建血管能力。因而任何能引起凋亡蛋白Bim的減少，或FOXO4表達下調，或Akt的非磷酸化都能引起EPCs數量的減少〔32〕。

4.2EPCs功能上調或數量增加 對高齡大鼠補充鐵鰲合劑去鐵胺，逆轉HIF-1α穩定劑，能改善EPCs在缺血部位的發揮血運重建的功能，其中關于HIF-1α與EPC之間機制關系尚待進一步的研究。另外在Akt-FOXO4-Bim這條途徑中，引起磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)增加，促進Akt的磷酸化，減少凋亡蛋白Bim的生成均可增加EPC功能的發揮。研究發現，音猬因子(shh)蛋白，他汀類、魚腥草等藥物能夠通過PI3K/Akt途徑刺激EPCs增殖、遷移，抑制其凋亡〔33，34〕。

HDL-C是EPCs的保護因素，而雌激素能夠上調HDL-C的表達，因而女性肥胖者體內的EPC數量和質量相對男性肥胖者要高。另外，一些細胞因子如VEGF，SDF-1α，缺血組織通過HIF-1α、胰島素樣生長因子(IGF)等也都能刺激增加EPCs的表達，增強后者的血管重建能力。也有研究發現適當的體育鍛煉，減少氧化應激反應能增加血管抗損傷能力，增多血管因子的數量及加強EPCs修復重建血管功能的發揮〔35〕。

此外，一些血液循環中的因子如SDF-1α,粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF),白細胞介素(IL)-8和裂解酶均參與動員EPCs從骨髓中遷移到外周血液中。同樣，HIF-1α介導釋放單核細胞趨化蛋白(MCP)-1〔36〕和紅細胞生成素(EPO)〔37〕，后者與靶細胞上的基質細胞衍生因子-1受體(CXCR)-4結合從而促進EPCs的遷移、歸巢和分化。

1Asahara T,Masuda H,Takahashi T,etal.Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization〔J〕.Circu Res,1999;85(3):221-8.

2Takayuki A,Tomono T,Haruchika M,etal.VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells〔J〕.Embo J,1999;18(14):3964-72.

3Asahara T,Murohara T,Sullivan A,etal.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis〔J〕.Science,1997;275(5302):964-7.

4Petri S,Satu M,Riitta A,etal.VEGFR-3 and CD133 identify a population of CD34+lymphatic/vascular endothelial precursor cells〔J〕.Blood,2003;101(1):168-72.

5Nikos W,Stefan J,Ulrich L,etal.Intravenous transfusion of endothelial progenitor cells reduces neointima formation after vascular injury〔J〕.Circ Res,2003;93(2):26.

6彭 艷，徐 玲，徐 勇.臍血內皮祖細胞治療糖尿病大鼠下肢缺血的實驗研究〔J〕.中國糖尿病雜志,2013;21(1):76-9.

7Kim SW,Han H,Chae GT,etal.Successful stem cell therapy using umbilical cord blood-derived multipotent stem cells for Buerger's disease and ischemic limb disease animal model〔J〕.Stem Cells,2006;24(6):1620-6.

8Edelberg JM,Reed MJ.Aging and angiogenesis〔J〕.Front Biosci,2003;8(8):s1199-209.

9Lakatta EG,Daniel L.Arterial and cardiac aging:major shareholders in cardiovascular disease enterprises:Part Ⅰ:aging arteries:a "set up" for vascular disease〔J〕.Circulation,2003;107(1):139-46.

10余道江，趙天蘭，徐又佳，等.內皮祖細胞對狹長窄蒂皮瓣成活面積的影響〔J〕.中華全科醫學,2011;9(12):1838-9.

11鄭勝武，昝 濤，鄭清健，等.骨髓血管內皮祖細胞移植提高缺血皮瓣存活率的研究〔J〕.中國美容醫學,2010;12(12):1805-8.

12Murayama T,Tapper OM,Silver M,etal.Determination of bone marrow-derived endothelial progenitor cell significance in angiogenic growth factor-induced neovascularization in vivo〔J〕.Exp Hematol,2002;30(8):967-72.

13趙永剛，范金才.靜脈淤血組織的成活機制探討〔J〕.中國美容整形外科雜志,2007;18(6):470-3.

14Sai Y,Nishimura T,Muta M,etal.Basic fibroblast growth factor Is essential to maintain endothelial progenitor cell phenotype in TR-BME2 cells〔J〕.Biol Pharmaceutical Bull,2014;37(4):688-93.

15Guo S,Yang X,Cheng Y,etal.bFGF and PDGF-BB have a synergistic effect on the proliferation,migration and VEGF release of endothelial progenitor cells〔J〕.Cell Biol Int,2010;35(5):545-51.

16孫 衛，趙天蘭，余道江，等.重組人生長激素促進狹長窄蒂皮瓣成活及堿性成纖維細胞因子表達的研究〔J〕.中華實驗外科雜志,2014;31(2):335-7.

17易成剛，郭樹忠，張琳西，等.血管內皮細胞生長因子基因轉染血管內皮祖細胞移植促進缺血皮瓣存活的實驗研究〔J〕.中華醫學雜志,2005;85(7):473-8.

18董 勇，李文志，辛 毅，等.血管內皮生長因子和雌二醇促進血管內皮祖細胞分化生成血管的對比研究〔J〕.中國美容醫學,2013;22(1):48-50.

19Akita T,Murohara TH,Sasaki K,etal.Hypoxic preconditioning augments efficacy of human endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization〔J〕.Laboratory Investigation,2003;83(1):65-73.

20伍麗君，趙天蘭，余道江，等.乒乓球拍樣皮瓣成活過程中基質細胞衍生因子-1、CD34的表達〔J〕.中華實驗外科雜志,2011;28(5):688-90.

21Yuen DA,Connelly KA,Andrew A,etal.Culture-modified bone marrow cells attenuate cardiac and renal injury in a chronic kidney disease rat model via a novel antifibrotic mechanism〔J〕.PLoS One,2010;5(3):e9543.

22Gilbert RE,Zhang Y,Yuen DA.Cell therapy for diabetic nephropathy:is the future,now〔J〕.Semi Nephrol,2012;32(5):486-93.

23Zhang Y,Yuen D,Advani A,etal.Early-outgrowth bone marrow cells attenuate renal injury and dysfunction via an antioxidant effect in a mouse model of type 2 diabetes〔J〕.Diabetes,2012;61(8):2114-25.

24楊 晨，張志華，盧士紅，等.臍血內皮祖細胞移植改善肢體缺血的研究〔J〕.中華醫學雜志,2003;83(16):1437-41.

25Chang EI,Shang AL,Ceradini DJ,etal.Age decreases endothelial progenitor cell recruitment through decreases in hypoxia-inducible factor 1α stabilization during ischemia〔J〕.Circulation,2007;116(24):2818-29.

26Chen YH,Lin SJ,Lin FY,etal.High glucose impairs early and late endothelial progenitor cells by modifying nitric oxide-related but not oxidative stress-mediated mechanisms〔J〕.Diabetes,2007;56(6):1559-68.

27Rossi F,Bertone C,Michelon E,etal.High-density lipoprotein cholesterol affects early endothelial progenitor cell number and endothelial function in obese women〔J〕.Obesity,2013;21(11):2356-61.

28Amir L,Zeiher AM.Endothelial function:cardiac events〔J〕.Circulation,2005;111(3):363-8.

29Hill JM,Gloria Z,Halcox JPJ,etal.Circulating endothelial progenitor cells,vascular function,and cardiovascular risk〔J〕.New Engl J Med,2003;348(7):593-600.

30Mandraffino G,Sardo MA,Riggio S,etal.Smoke exposure and circulating progenitor cells:evidence for modulation of antioxidant enzymes and cell count〔J〕.Clin Biochem,2010;43(18):1436-42.

31Jin H,Chang Hwan Y,Choon Soo L,etal.Akt is a key modulator of endothelial progenitor cell trafficking in ischemic muscle〔J〕.Stem Cells,2007;25(7):1769-78.

32Dimmeler S,Zeiher AM.Akt takes center stage in angiogenesis signaling〔J〕.Circ Res,2000;86(1):4-5.

33Fu JR,Liu WL,Zhou JF,etal.Sonic hedgehog protein promotes bone marrow-derived endothelial pro-genitor cell proliferation,migration and VEGF production via PI 3-kinase/Akt signaling pathways〔J〕.Acta Pharmacol Sinica,2006;27(6):685-93.

34Cai DS,Zhou H,Liu WW,etal.Protective effects of bone marrow-derived endothelial progenitor cells and Houttuynia cordata in lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats〔J〕.Cell Physiol Biochem,2013;32(6):1577-86.

35Ross MD,Wekesa AL,Phelan JP,etal.Resistance exercise increases endothelial progenitor cells and angiogenic factors〔J〕.Med Sci Sports Exerc,2014;46(1):16-23.

36Capoccia BJ,Gregory AD.Recruitment of the inflammatory subset of monocytes to sites of ischemia induces angiogenesis in a monocyte chemoattractant protein-1-dependent fashion〔J〕.J Leukocyte Biol,2008;84(3):157.

37Christopher H,Alexandra A,Ralf L,etal.Erythropoietin is a potent physiologic stimulus for endothelial progenitor cell mobilization〔J〕.Blood,2003;102(4):1340-6.