不可逆電穿孔消融同種異體肌腱移植對兔肌腱缺損修復的實驗研究*

康云 王永強 宋越 雷軍玲

(1.陜西省榮譽軍人康復醫院外二科，陜西 華陰 714200；2.中國人民解放軍第二0二醫院 婦產科/泌尿外科，遼寧 沈陽 110000)

臨床上肌腱損傷較常見，其中肌腱缺損約占手部肌腱損傷的1/4[1]。肌腱移植在手足重建外科中應用廣泛，可用于修復肌腱缺損、恢復關節穩定性。單條肌腱缺損修復可考慮自體肌腱移植[1-2]，但多條或多段肌腱缺損的修復仍是臨床面臨的棘手問題。目前臨床上常見的各種肌腱移植修復方式均存在一定的缺陷：自體肌腱由于來源有限，取材后影響肢體的外觀與功能；人工肌腱存在材料與受體肌腱愈合困難等問題尚未解決，臨床推廣緩慢[2]；同種異體肌腱存在免疫排斥反應、組織再血管化緩慢等不足[4]，但因其來源相對充足、取材方便，可避免損傷患者肢體結構與功能等優點，已成為修復該類肌腱缺損較理想方法。目前國際上對于同種異體肌腱移植前預處理方法普遍接受的是程序性深低溫冷凍法。但由于深低溫法易在腱細胞內外形成冰晶，破壞了腱細胞的生物活性，且不可避免的對細胞外基質等水合性纖維網絡凝膠結構造成損傷，術后存在諸如宿主免疫排斥反應重、腱細胞爬行替代緩慢、遠期力學強度欠佳、外源性愈合易形成粘連等問題，遠期修復效果不理想[3]。

不可逆電穿孔消融法(irreversible electroporation，IRE)是一種近年來發展起來的的新型組織滅活方法，IRE原理是在特定電場強度作用下，細胞膜上出現永久性納米級微孔，細胞因內環境穩態破壞而死亡[5]。我們既往使用IRE技術原位滅活兔跟腱，確認膠原纖維組成的肌腱框架組織可以完整保留，消融術后12周時肌腱的組織形態及生物力學性能可以恢復至正常對照水平[6]。本實驗擬采用IRE技術消融對同種異體肌腱移植修復兔肌腱損傷，探討IRE滅活的同種異體肌腱移植修復肌腱缺損的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器 6月齡雄性新西蘭大白兔112只，體重(2.5 ± 0.5)kg，由第四軍醫大學實驗動物中心提供；Microfil硅膠灌注液(Flow Tech公司，美國)；手持式平行板電極夾(BTX公司，美國)；游標卡尺(精確度0.02 mm；上海量具刃具廠有限公司)；Instron-3300萬能試驗機(Instron公司，美國)。

1.2 分組及實驗方法

1.2.1 分組 112只兔隨機分為3個實驗組和1個對照組，自體肌腱移植組(A組)28只，深低溫冷凍同種異體肌腱移植組(B組)28只，IRE滅活同種異體肌腱移植組(C組)28只和假手術對照組(D組)28只。

1.2.2 方法 A組：肌肉注射陸眠寧(0.1 mL/kg)麻醉動物后，于雙后肢第3足趾鞘管區作縱切口顯露屈趾肌腱，分別切斷長約2 cm的第3趾深屈肌腱，使用5～0絲線，采用改良Kessler法及外周縫合法將切取的肌腱左右互換后行端端縫合并加固。B組：麻醉、取材及縫合方法同A組，取動物左后肢相同部位肌腱，關閉切口，使用絲線標記肌腱后以冷凍保護劑浸泡2 小時，然后置于-80 ℃冰箱內2周；2周后取肌腱室溫復溫，按A組方法于動物右后肢第3趾深屈肌腱制備長約2 cm缺損，根據標記隨機選取非自體肌腱進行移植。C組：麻醉后顯露右后肢第3趾深屈肌腱，采用手持式平行板電極夾持肌腱，經游標卡尺測量確保兩平板電極間距離為3 mm。IRE消融采用連續10個電場強度1 800 V/cm、波長100 μs、間隔100 ms的電脈沖為1組輸出，共輸出9組脈沖[6-7]。消融參數預先設置，消融全程采用電腦控制，示波器監視脈沖輸出的電壓、波長、間隔、數量等是否符合預設值。消融全程觀察兩電極間是否有滲血，發現滲血及時清除，避免短路。消融完成后將消融段肌腱完整切斷備用，關閉右后肢切口，按A組方法于動物左后肢第3趾深屈肌腱制備長約2 cm缺損，根據標記隨機選取非自體肌腱進行移植，縫合方法同A組。D組：動物麻醉后僅顯露右后肢第3趾深屈肌腱，不做任何其他處理，同上法縫合關閉切口。

術后所有動物回籠飼養，患肢自由負重。術后3 天每日給予美洛昔康2 mg/kg，1/8小時肌注以緩解疼痛。術后1、4、8、12周，各組分別取7只動物，其中2只麻醉后行微血管灌注，其余動物耳緣靜脈推注20 mL 10 %氯化鉀處死，靶肌腱先行大體觀察，再取其中2條進行組織學觀察，余3條進行生物力學測試。

1.3 觀測指標

1.3.1 微血管灌注觀察 動物麻醉后，腹主動脈插管灌注Microfil硅膠灌注液，取灌注后的肌腱，大體觀察移植肌腱有無斷裂，是否水腫等。然后將其平均分為4等份，游標卡尺測量3個分割點處肌腱直徑，取均值。0周數據為各組處理前測量結果。灌注肌腱經冷凍、脫水、透明、石蠟包埋，6 μm切片，伊紅染色，使用Image Pro Plus 11.0軟件測量移植肌腱微血管有效灌注面積(6)。

1.3.2 組織學觀察 4 %多聚甲醛固定肌腱，經脫水、透明、浸蠟，切片，常規HE染色，鏡下觀察。

1.3.3 生物力學測試 取第3趾深屈肌腱全長，兩端分別固定于冷凍夾具中，肌腱均未預先行周期性拉伸。維持室溫25 ℃，給予0.5 N拉力，測試機兩端以10 mm/s相對速度分離，直至肌腱斷裂，電腦自動描記載荷-位移曲線。肌腱斷裂時的載荷及位移即為最大載荷及破損形變，計算硬度(最大載荷/破損形變)。

2 結果

2.1 移植肌腱及微血管灌注觀察 實驗期間，各組動物均無死亡，手術切口愈合良好，切口無紅腫、滲出及裂開，各組肌腱均未發生斷裂，(見圖1)術后1周，A、B、C組移植肌腱無明顯水腫；術后4周，A、B、C組移植肌腱均存在輕微水腫；術后8周，B組移植肌腱輕微水腫，A、C組情況與D組無顯著性差異；術后12周，A、B、C組大體觀察與D組無明顯差別。綜合結果，A、B、C、D組在各時間點肌腱直徑差異無統計學意義(P> 0.05)，見表1。

術后1周，A、B、C組微血管有效灌注面積顯著低于D組，比較差異有統計學意義(P< 0.05)；A、B、C組間比較差異無統計學意義(P> 0.05)。4周時，B組顯著低于A、C、D組，差異有統計學意義(P< 0.05)，A、C、D組間比較差異無統計學意義(P> 0.05)。8周時，B組顯著低于A、C、D組，差異有統計學意義(P< 0.05)；A、C組顯著高于D組，比較差異有統計學意義(P< 0.05)，A、C組間比較差異無統計學意義；12周時，B組顯著低于A、C、D組，差異有統計學意義(P< 0.05)，A、C、D組間比較差異無統計學意義(P> 0.05)，見圖2。

圖1術后各時間點各組實驗兔肌腱大體觀察
Figure1Grossobservationoftendonsineachtimepointineachgroup

表1 各組實驗兔移植肌腱直徑比較Table 1 Comparison of diameter of transplanting tendon

圖 2 各時間點各組實驗兔肌腱微血管有效灌注面積比較。

Figure2Comparisonofmicrovasculareffectiveperfusionareaateachtimepoint.

2.2 各組實驗兔組織學觀察 D組肌腱膠原纖維呈波浪狀，與肌腱長軸平行，肌腱細胞核呈扁梭形，均勻散在分布于膠原纖維間隙內。術后1周，A、B、C組肌腱細胞均消失；術后4周，與B組比較，A、C組標本中可見較多成纖維細胞核散在分布于膠原纖維中間，肌腱外膜增厚，微血管開始長入；術后8周，A、C組可見成纖維細胞大量增殖，聚集在新生毛細血管周圍，膠原纖維之間成纖維細胞繼續增加；而B組肌腱內成纖維細胞數量較前增加不明顯；術后12周，A、C組肌腱膠原纖維排列較整齊，成纖維細胞在膠原纖維間出現局灶性聚集，B組較8周時無明顯變化，見圖3。

2.3 各組實驗兔生物力學測試 術后4周時肌腱最大載荷B、D組間比較，差異有統計學意義(P< 0.05)；術后1、8、12周時，各組最大載荷比較，差異均無統計學意義(P> 0.05)。各時間點各組移植肌腱破損形變比較，差異均無統計學意義(P> 0.05)。術后1、4、12周時，各組肌腱硬度比較，差異均無統計學意義(P> 0.05)；術后8周時B、D組間比較，差異有統計學意義(P< 0.05)，見表2～4。

圖3 術后各時間點各組實驗兔肌腱組織學觀察(標尺=50 μm) Figure 3 Histological observation of tendon in each time point

分組n術后各時間點移植肌腱最大載荷(N)1周4周8周12周A組3341±52336±42329±40319±41B組3331±46215±38①251±29276±34C組3359±56360±45316±52298±31D組3329±27311±32331±76325±48F0．8597．7101．5660．973P0．5010．0100．2720．452

注：與D組比較，①P< 0.05

表3 各時間點實驗兔移植肌腱破損形變比較Table 3 Comparison of damage deformation at each time point

表4 各時間點實驗兔移植肌腱硬度比較Table 4 Comparison of hardness at each time point

注：與D組比較，①P< 0.05

3 討論

全世界范圍內每年有超過3000萬的肌腱損傷患者。肌腱或韌帶組織由于血供和細胞密度小(5 %)，再生能力弱，組織修復后形成的纖維瘢痕中含有大量Ⅲ型膠原纖維，因其組織結構松散、力學性能差，故易發生粘連，常常導致關節疼痛和功能障礙，嚴重影響患者的日常生活和工作。臨床上經常會面對大段肌腱缺損需要移植的情況，理想的移植肌腱的特點應該是：①直徑和長度足夠，獲取容易。②與替代的肌腱具有相似的生物學特性。③可以保留或提供新的血運。④不存在炎癥及免疫排斥反應。⑤有足夠的力學強度。對于大段肌腱缺損的患者，目前移植物選材主要包括自體肌腱、同種異體肌腱、人工肌腱和組織工程化肌腱等。

對比之下，同種異體肌腱移植的優勢在于：①來源豐富、取材方便。②對宿主正常組織結構和功能無損傷。③保持肌腱原有生物結構特性。④手術時間短。近幾年來，同種異體肌腱作為自體肌腱的替代品，經實驗和臨床研究證實安全有效，其主要應用包括：跟腱、手部肌腱、肩鎖關節韌帶及前交叉韌帶損傷等的修復重建。目前國際上對于同種異體肌腱移植前預處理方法普遍接受的是程序性深低溫冷凍法(深低溫冰箱-70 ℃至-80 ℃，液氮-196 ℃)。但由于深低溫法易在腱細胞內外形成冰晶，破壞了腱細胞的生物活性，且不可避免的對細胞外基質等水合性纖維網絡凝膠結構造成損傷，術后存在諸如宿主免疫排斥反應重、腱細胞爬行替代緩慢、遠期力學強度欠佳、外源性愈合形成粘連等問題，遠期修復效果不理想。

IRE是一種新型、快速、精準的組織消融方法，由于破壞了細胞膜的完整性，不影響膠原纖維網絡，因此能夠在有效消融的基礎上保留肌腱的基本框架結構[7]，這使得滅活區域肌腱組織存在再生的可能。一切熱滅活方法通常因為滅活范圍隨溫度升高以及滅活時間的延長而不斷增加，造成滅活范圍控制困難；而IRE可以設定一個準確的滅活范圍，然后對組織實施精確滅活。對于一個細胞來講，使用電穿孔后的結果是全或無的，也就是細胞或者可以生存，或者發生死亡。更重要的是，IRE僅對活細胞膜發生作用，而不損傷其他的組織結構。IRE不會引起蛋白質變性，而這一變化正是許多熱滅活方法常無法避免的。另外IRE不受周邊大血管血流的影響，IRE不損傷大血管和膽管系統，由于對供血系統的保留，并快速激活了免疫系統，滅活組織的再生速度快，組織疤痕修復概率小。

基于IRE獨特的技術優勢：IRE滅活范圍內重要的組織結構不發生毀損、滅活時程短、滅活邊界清晰、滅活全程可以實時監控、IRE引發細胞凋亡、不受“冷庫效應”及“熱庫效應”的影響等。本實驗使用IRE消融的同種異體肌腱移植修復肌腱缺損，結果顯示，由于相對不產熱，IRE未對肌腱的膠原纖維網絡結構造成損傷，故術后無肌腱斷裂發生；同時，由于消融全程非熱源依賴，IRE消融移植組肌腱無論在組織形態、微血管數量及生物力學性能恢復等方面均與自體肌腱移植組無顯著性差異；IRE消融移植組肌腱在術后通過肌腱母細胞爬行替代、腱包膜和腱內膜的再生以及向肌腱纖維束向內部長入、腱束內微血管再生、膠原原纖維的重塑及力學性能恢復等一系列方式完成重建修復。

肌腱整體的生物力學性能改變是客觀評價肌腱功能恢復的重要指標。組織學分析表明膠原原纖維在IRE后經歷了三個狀態，分別是外觀上未見明顯損傷、膠原原纖維直徑變細并且間隙增大、膠原塑形修復三個相互之間部分重疊的過程，因此膠原纖維生物力學性能也勢必會隨組合結構變化而發生改變。同種異體肌腱和自體肌腱一樣，在移植術后都需要經過一個愈合過程，包括吻合口的連接、肌腱的再血管化、膠原原纖維的再生和應力塑形等[8,14-16]。傳統深低溫冷凍法預處理的異體肌腱由于冰晶對肌腱的影響，其在組織形態學和生物力學的恢復方面與自體肌腱尚存在一定的差距。我們既往使用兔模型證實了IRE消融的自體跟腱在術后第4周時已開始再血管化，至第12周時跟腱組織形態和生物力學性能與正常跟腱已無顯著性差異(3)；我們還發現位于IRE消融邊緣處的腱母細胞和位于腱內膜處的腱母細胞向消融區域爬行替代完成了組織再生修復過程，這些爬行替代的細胞可能是IRE消融區段腱母細胞的一個重要來源。本實驗中，術后1周時肌腱內微血運完全中斷，考慮為微血管內皮細胞死亡造成管腔閉塞，但由于膠原纖維網絡的保留，微血管的修復和再生可以快速完成，并最終在數量上達到了正常肌腱生理代謝所需的水平[10-13]。在本實驗全部觀察時間段中，深低溫處理的同種異體腱與自體移植腱及IRE消融的同種異體腱相比，其成纖維細胞再生、微血管再生及新生膠原纖維的塑形改建過程均明顯延遲；深低溫組肌腱再血管化遲滯，而合成的新生膠原纖維由于排列欠規則，由此其生物力學性能在移植術后的一段時間內發生減損是可以解釋的[17-19]；而IRE消融組肌腱在整個實驗觀測過程中由于膠原纖維的連續性得以保留，無膠原原纖維的微破裂發生，因此肌腱強度在術后保持相對平穩，這些組織框架結構的完整保留有利于肌腱細胞術后早期的爬行替代和微血管快速再生修復[20-21]。

本實驗尚存在的不足：①樣本量較小，僅為單中心實驗數據，IRE技術的應用尚需要在多種大、中型動物體內獲得更多實驗數據的支持。②觀察時間較短。③雖然既往研究證實IRE可以在有效消融組織細胞的同時不引起特定的細胞免疫反應[11]，但是不除外消融的腱細胞碎片被吞噬清除的過程包含著部分免疫應答，我們的實驗僅觀察了消融術后異體肌腱移植的短期臨床效果。④IRE技術的開展應用目前尚需要充足的設備資源，本實驗沒有采用小型、輕量化的電穿孔設備進行實驗，研究步驟和方案有待進一步精簡。總之，IRE能否用于包括肌腱、韌帶在內的結締組織尚是一個有待深入探索的問題。按照既往的研究結果分析推理，IRE有望克服傳統熱滅活的部分弊端，但同時由于IRE自身存在很多技術上的限制，包括脈沖設備的組建、電壓安全性的要求、個體化病人的適應性、生物組織的多樣性和不均一性等等，這些都阻礙了IRE的應用。

4 結論

采用IRE滅活的同種異體肌腱修復兔肌腱缺損切實可行，術后移植肌腱組織形態及生物力學性能恢復與自體肌腱移植組無顯著差異。

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