食用/工業明膠的凝膠及LF-NMR弛豫特性的比較

王 欣，郭 琦，黃遠芬，谷桂英，劉寶林

(上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海 200093)

明膠按其用途可分為藥用明膠、食用明膠、工業明膠與照相明膠，其中藥用明膠與食用明膠具有嚴格的國家或行業標準。2012年“毒膠囊”與“皮革酸奶”事件引起了人們對于食品及膠囊中所添加的明膠質量的關注。工業與食用明膠在品質及安全性上存在較大差異，工業明膠的原材料來源多為經過鞣制的皮革下腳料，其中含有重金屬的鞣制劑及其他雜質會對人體健康造成危害[1]。

但若依照現有標準中反映明膠品質的重要指標(凝凍強度、黏度)進行判別，則會發現，QB/T 1995-2005《工業明膠》中規定明膠(12.5%)的凝凍強度≥200 g，黏度≥6 mPa·s，GB 6783-2015《食用明膠》中規定明膠(6.67%)的凝凍強度≥50 g，對黏度則無要求，標準之間存在一定的模糊性，難以有效鑒別明膠的品質。盡管目前主要通過石墨爐原子吸收光譜法[2]、電感耦合等離子體質譜法[3]、激光誘導擊穿光譜法[4]檢測明膠樣品中的鉻含量是否超標來判斷明膠品質。但僅通過測定鉻含量很難準確鑒別食品體系中是否添加工業明膠，尤其是不法企業若將工業明膠與食用明膠攙兌使用，其鉻含量則可能滿足國標(2 mg/kg) 要求。因此，衛生部發布的《食品中可能添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑名單》上缺少工業明膠的檢測方法[5]。說明仍有必要對能夠反映食用和工業明膠品質差異的特性進行比較研究，從而為保證食用明膠安全提供新的方法。

低場核磁共振技術(Low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR)可以表征生物大分子系統內水分子的狀態、流動性和分布[6]。黃遠芬等[7]研究發現，LF-NMR技術可以有效反映明膠-蔗糖/NaCl凝膠體系中水分狀態及其比例的變化，且弛豫特性與凝凍強度間有良好的相關性。Hansen等[8]比較了不同淀粉膠體的LF-NMR弛豫特性，發現淀粉種類不同、改性程度不同，其LF-NMR弛豫圖譜有所區別，伴隨峰寬度及弛豫時間的改變。

考慮到由皮革下腳料所生產的工業明膠的螺旋結構、分子量分布及蛋白質鏈的尺寸均與食用明膠有所區別，因此，在膠凝過程中，其中的水分狀態及分布可能與食用明膠也不同。本研究在比較食品和工業明膠的黏度、凝凍強度及LF-NMR弛豫特性的基礎上，進一步分析了工業明膠攙兌比例對食用明膠相關特性的影響；分析了添加不同濃度的蔗糖或NaCl對食品/工業或二者混合物相關特性的影響。研究可為采用LF-NMR技術鑒別明膠品質提供一定的理論指導作用。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

食用明膠(B型骨膠)：羅賽洛明膠有限公司；工業明膠(B型)：杭州駿馬磨具五金商行；蔗糖、NaCl(均為分析純)購于上海國藥化學試劑有限公司；實驗用水為去離子水(自制)。

低場核磁共振分析儀(LF-NMR)：PQ-001型，氫譜，磁場強度(0.5±0.08) T，質子共振頻率23 MHz，上海紐邁電子科技有限公司；質構分析儀：TA. XT Plus型，英國SMS公司；數顯旋轉粘度計：NDJ-5S型，上海昌吉地質儀器有限公司；恒溫水浴鍋：HH·S21型，上海博訊實業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品的配制按表1中各處理條件的要求，稱取一定量的明膠至相應的溶劑中，在室溫下放置1～2 h，充分溶脹后，60 ℃水浴攪拌，形成一定濃度、均勻的明膠溶液后，室溫下過夜，備用。

明膠溶液濃度是指體系的總濃度，工業明膠的摻入以質量分數計，為10%～100%；研究蔗糖和NaCl對明膠體系的影響時，混合明膠是指食用/工業明膠(質量比60∶40)。

表1 不同明膠溶液的配制Table 1 Preparation of different gelatin solutions

1.2.2檢測方法黏度：取400 mL待測溶液恒溫至35 ℃后，采用旋轉粘度計測量其黏度。

凝凍強度：移取120 mL待測溶液至凍力瓶中，4 ℃冰箱放置12 h，充分凝膠后，采用質構儀測量凝凍強度。具體參數如下：探頭P/0.5，測試前速度1.50 mm/s，觸發力10 g，測試速度1.00 mm/s，測試距離20.00 mm，返回速度10.00 mm/s。

LF-NMR弛豫特性：準確移取3 mL明膠溶液于直徑為15 mm的核磁共振專用試管中，置于4 ℃下保持12 h后，在以下參數條件下采樣：CPMG 脈沖序列，重復采樣等待時間(TR)=6 000 ms，重復掃描次數(NS)=4次，譜寬(SW)=250 kHz，半回波時間(τ)=500 μs，回波個數(EchoCount)=15 000個，采樣點數(TD)=3 750 126。

應用T-invfit軟件對采樣得到的CPMG指數衰減曲線進行反演擬合，得到明膠凝膠體系的多組分弛豫圖譜，并獲知各弛豫峰的弛豫時間(按出峰時間從小到大命名為T21、T22、…、T2i等)及其相應的峰面積百分比(S21、S22、…、S2i等)。將樣品看作一個整體組分分析時，可反演得到樣品的單組分弛豫時間(T2w，ms)。

1.3 數據處理

每個樣品重復檢測3次，應用SPSS 18.0軟件對數據進行顯著性差異分析，以P<0.05(差異顯著)作為差異顯著性判斷標準，應用Origin 8.0軟件繪圖。

2 結果與討論

2.1 食用/工業明膠體系的凝膠特性與LF-NMR弛豫特性

2.1.1凝膠特性明膠的濃度、分子量分布及蛋白質鏈的尺寸是影響明膠凝膠特性的重要因素[9]。考察了食用/工業明膠體系的黏度和凝凍強度隨明膠濃度的變化，結果顯示，隨明膠濃度的增加，食用/工業明膠體系的黏度均呈二項式增大趨勢(r2>0.96)，凝凍強度均呈線性增大趨勢(r2>0.96)。這是由于，明膠的親水基團可與水分子相互作用形成氫鍵，隨著明膠濃度的增加，體系中氫鍵的數目增多，使明膠分子間相互作用及明膠水合作用增強，促進了明膠的凝膠化，凝凍強度增大；同時，體系的流動性整體降低，黏度隨之增大，這與安廣杰等[10]的研究結果相符。另一方面，與食用明膠相比，由于工業明膠是由皮革下腳料所生產，其原料、提取過程的區別使其分子量分布及蛋白質鏈的尺寸均與食用明膠有所不同，加之含有雜質相對較多，使其凝凍強度和黏度較低，且濃度越高，兩體系的區分越大。

圖1 食用/工業明膠體系的LF-NMR多組分弛豫圖譜Fig.1 LF-NMR multi-component relaxation map of edible/industrial gelatin systemedible gelatin system(EG),industrial gelatin system(IG)

2.1.2LF-NMR弛豫特性食用/工業明膠體系的部分多組分弛豫圖譜如圖1所示。由圖1可知，水僅在1 873.82 ms處產生1個峰，而食用/工業明膠體系產生了2～3個弛豫峰，依弛豫時間分別命名為T2b、T21和T22峰。T2b峰反映了明膠肽鏈上不可交換的氫質子的核磁響應[11]，其信號較弱，重現性較差，且與明膠濃度間無規律性變化。T21峰與T22峰穩定存在，食用明膠的T21峰在3.00～15.24 ms之間，T22在57.22～305.39 ms之間，工業明膠的T21峰則位于14.18～29.38 ms，T22位于152.99～613.59 ms之間，一般認為，弛豫時間較短的T21峰反映的是與明膠肽鏈上親水基團通過氫鍵緊密結合的“結合水”，而弛豫時間較長的T22峰則反映了與明膠相互作用較弱的“自由水”[7]。進一步分析食用/工業明膠體系的多組分弛豫特性隨濃度的變化。結果如圖2所示。

由圖2可知，隨明膠濃度的增加，兩明膠體系的T21、T22均呈二項式縮短趨勢(r2>0.99)，S21線性增大(r2>0.97)，而S22線性降低(r2>0.99)。這說明隨明膠濃度的增加，明膠的水合作用及明膠分子之間的相互作用增強，水分子中的氫質子所受束縛增強，水分的流動性降低，弛豫時間(T21、T22)均相對縮短，結合水比例(S21)增大，而自由水比例(S22)減小。

與食用明膠相比，工業明膠具有相對較大的弛豫時間(T21、T22)，說明整體而言，工業明膠對氫質子的束縛相對較弱。但比較各峰的峰面積比例可以發現，工業明膠的S21相對較高，而S22相對較低。這可能是由于工業明膠的蛋白質鏈尺寸較小，且存在有較多數量的小分子量組分，使得更多的親水基團(如羧基、氨基等)暴露出來并與水結合，因而使反映結合水比例的S21相對增大，而自由水比例(S22)相對較小。

2.2 混合明膠體系的凝膠特性與LF-NMR弛豫特性

2.2.1凝膠特性混合明膠體系的黏度與凝凍強度的變化如圖3所示。

圖3 混合明膠體系的黏度與凝凍強度隨工業明膠含量的變化Fig.3 Changes in viscosity and gel strength of edible/industrial gelatin with gel concentrations

由“2.1.1”可知，工業明膠的凝凍強度與黏度均相對較低，圖3顯示，當摻入10%的工業明膠時，食用明膠體系的黏度及凝凍強度均顯著降低(P<0.05)，且隨摻雜量的增加，體系的黏度和凝凍強度均呈線性降低(r2>0.98)，說明可以借助黏度和凝凍強度隨工業明膠比例增加而減小的規律來區分明膠品質。

2.2.2LF-NMR弛豫特性混合明膠體系的弛豫特性隨工業明膠含量的變化如圖4所示。由前文可知，工業明膠體系的弛豫時間相對較大，圖4表明，對混合明膠體系而言，隨工業明膠含量的增加，體系的弛豫時間(T21、T22)、結合水比例(S21)均呈良好的線性增加趨勢(r2>0.98)，而自由水比例(S22)呈線性降低趨勢(r2=0.97)。以上結果表明，隨著工業明膠摻兌比例的增加，混合體系的LF-NMR弛豫特性(T21、T22、S21、S22)呈一定規律的變化，且與黏度和凝凍強度的測定過程不同，LF-NMR分析具有無損、快速的優勢，為快速確定明膠體系中工業明膠攙兌比例提供了新的可能途徑。

2.3 蔗糖對不同明膠體系的凝膠特性與LF-NMR弛豫特性的影響

2.3.1凝膠特性凝膠體系的凝膠特性不僅與膠體種類及濃度有關，其它組分的添加也會影響其凝膠特性。添加蔗糖對食用、工業及混合明膠體系的黏度與凝凍強度的影響如圖5所示。

圖5 不同明膠體系的黏度(A)與凝凍強度(B)隨蔗糖質量分數的變化Fig.5 Changes of viscosity(A) and gel strength(B) of different gelatin systems with sucrose concentrationedible gelatin system(EG)；industrial gelatin system(IG)；mixed gelatin system(MG)

由圖5可知，整體而言，食用明膠體系的黏度、凝凍強度相對較大，混合明膠體系次之，而工業明膠體系最小。由圖5A可知，隨蔗糖質量分數的增加，各明膠體系的黏度均線性增大(r2>0.91)；由圖5B可知，食用明膠與混合明膠(質量比：食用∶工業=60∶40)體系的凝凍強度均隨蔗糖質量分數的增加而呈二項式增大趨勢(r2>0.80)，而對工業明膠體系而言，添加5%蔗糖時，體系的凝凍強度相對增大，而當蔗糖質量分數>5%時，體系的凝凍強度則基本不變(P>0.05)。這是由于：一方面，蔗糖濃度的增加增大了溶液的黏度[12]，同時蔗糖的加入能夠促進明膠肽鏈與水的相互作用，削弱明膠體系的流動性，促進明膠的凝膠化，使體系黏度呈增大趨勢，增強凝膠體系的剛性。對工業明膠體系而言，其肽鏈上的大多數親水基團已與水分子“結合”，因此蔗糖的添加對工業明膠水合作用的促進作用并不明顯，因而對凝凍強度的影響較小。

2.3.2LF-NMR弛豫特性不同明膠體系的弛豫特性隨蔗糖質量分數的變化如圖6所示。由圖6可知，工業明膠體系的結合水弛豫時間(T21)相對較大，且T21隨蔗糖濃度的增大呈線性增加趨勢(r2=0.93)；對食用明膠和混合明膠體系而言，雖然與對照組相比，添加蔗糖后其T21顯著縮短(P<0.05)，但隨蔗糖濃度變化不大；各明膠體系的自由水弛豫時間(T22)均隨蔗糖濃度的增大而線性縮短(r2>0.92)。而各明膠體系的S21均呈二項式遞增趨勢(r2>0.88)，S22則均呈二項式遞減趨勢(r2>0.83)。整體而言，無論從弛豫時間還是弛豫峰面積比例上進行比較，添加蔗糖后，各系列間仍有明顯區別。

2.4 NaCl對不同明膠體系的凝凍強度與LF-NMR弛豫特性的影響

圖7 不同明膠體系的凝凍強度隨NaCl濃度的變化Fig.7 Changes of gel strength of different gelatin systems with NaCl concentration

2.4.1凝凍強度不同明膠體系的凝凍強度隨NaCl濃度的變化如圖7所示。 由圖7可知，食用明膠的凝凍強度最大，混合明膠次之，工業明膠最小；隨NaCl濃度的增加，食用明膠體系的凝凍強度呈二項式降低趨勢，工業/混合明膠體系的凝凍強度則呈線性降低趨勢。這是因為，NaCl的引入中和了蛋白質表面所帶電荷，改變了體系的靜電作用力，不利于明膠的膠凝作用[13]，因此隨NaCl濃度的升高，明膠凝膠的剛性減弱，凝凍強度減小。

2.4.2弛豫特性各體系的弛豫特性隨NaCl濃度的變化如圖8所示。由圖8可知，工業明膠體系的弛豫時間(T21、T22)仍相對較大，且具有較大的S21及較小的S22，NaCl濃度對3種明膠體系的結合水弛豫時間(T21)與自由水弛豫時間(T22)的影響規律性較小，但與對照組相比，各濃度下的T21、T22均相對延長，結合水比例(S21)呈增大趨勢，而自由水比例(S22)分別呈線性或二項式遞減趨勢(r2>0.78)。蛋白質凝膠的形成與維持是體系中各種吸引力與排斥力達到平衡的結果[14]。NaCl的引入不利于明膠的膠凝作用，使明膠膠體的剛性降低，凝膠中水分子的流動性增強，水分子的氫質子所受束縛力降低，因此表現為T21與T22相對延長。同時，由于NaCl中和了明膠表面的電荷，使明膠分子鏈展開[15]，導致更多的親水基團暴露出來，并與水結合，因此結合水比例(S21)仍相對增加，而S22相對減少。

3 結 論

本文主要研究了不同品質、濃度、混合比例及蔗糖或NaCl濃度對明膠凝膠體系黏度、凝凍強度及LF-NMR弛豫特性的影響規律。結果表明，與食用明膠相對比，工業明膠的凝凍強度與黏度均相對較低，弛豫時間(T21、T22)相對較長，S21相對較高，而S22相對較低。隨明膠濃度的增加，體系的黏度、凝膠強度均呈二項式增大趨勢。食用/工業明膠體系的T21、T22均呈二項式縮短趨勢，S21線性增大，S22線性減小。隨工業明膠含量的增加，混合明膠體系的黏度與凝凍強度均線性減小，體系的T21、T22均線性增大，S21線性增大，S22線性減小。隨蔗糖濃度的增加，各明膠體系的黏度均線性增大，食用與混合明膠體系的凝凍強度呈二項式增大趨勢，而工業明膠體系變化較小；工業明膠體系的T21相對增大，而食用/混合明膠體系的T21雖在添加蔗糖后顯著縮短，但隨蔗糖濃度的變化不大；各體系的T22均線性縮短，S21均呈二項式增大，S22均呈二項式減小趨勢。隨NaCl濃度的增加，各明膠體系的凝凍強度均呈降低趨勢。添加NaCl使各體系的T21、T22均相對增大,S21增大，而S22減小，但隨NaCl濃度的變化均較小。

[1] Kirman C R,Aylward L L,Suh M,Harris M A,Thompson C M,Haws L C,Proctor D M,Lin S S,Parker W,Hays S M.Chem.-Biol.Interact.,2013,204(1):13-27.

[2] Quinaia S P,Nobrega J A.FoodChem.,1999,64(3):429-433.

[3] Ge J H,Xu J H.J.ChinaPharm.(葛建華,徐繼華.中國藥業),2014,23(21):45-46.

[4] Zhang Y,Zhang D C,Ma X W,Pan D,Zhao D M.ActaPhys.Sin.(張穎,張大成,馬新文,潘冬,趙冬梅.物理學報),2014,63(14):231-235.

[5] Zhao L Y,Che S D,He Y K,Li C C,Zhu X Y,Yuan Q X,Zeng F H.TheScienceandTechnologyofGelatin(趙龍巖,車壽德,何銀開,李春橙,朱小亞,袁清霞,曾富華.明膠科學與技術),2012,32(3):131-132.

[6] Liu J J.StudyonFunctionalPropertiesandPhaseBehaviorofEggWhiteProtein/KonjacGlucomannanCompositeSystem.Wuhan：Huazhong Agricultural University( 劉金金.蛋清蛋白/魔芋膠復合體系功能特性及相行為研究.武漢：華中農業大學)，2013.

[7] Huang Y F,Wang X,Liu B L.Mod.FoodSci.Technol.(黃遠芬,王欣,劉寶林.現代食品科技),2015,31(10):45-52.

[8] Hansen M R,Blennow A,Farhat I A,Norgaard L,Pedersen S,Engelsen S B.FoodHydrocoll,2009,23:2038-2048.

[9] Huang B C,Li C X.Sci.Technol.Gelatin(黃壁成,李承獻.明膠科學與技術),2013,33(3):139-142.

[10] An G J,Wang Z.FoodSci.(安廣杰,王璋.食品科學),2007,28(7):68-72.

[11] Chiotelli E,Pilosio G,Meste M L.Biopolymers,2002,63(1):41-58.

[12] Galmarini M V,Baeza R,Sanchez V,Zamora M C，Chirife J.LWT-FoodSci.Technol.,2011,44(1):186-190.

[13] Choi S S,Regenstein J M.J.FoodSci.,2000,65(2):194-199.

[14] Kan J Q,Duan Y F,Jiang F T.FoodChemistry.Beijing:China Agricultural University Press(闞建全,段玉峰，姜發堂.食品化學.北京:中國農業大學出版社),2009.

[15] Kaewruang P,Benjakul S,Prodpran T,EncarnacionA B，Nalinanon S.LWT-FoodSci.Technol.,2014,55(2):477-482.