渾源黃芪地上部分與地下部分中黃酮類成分比較

徐 珍，李 倩，劉亮亮，郭愛華

（山西職工醫(yī)學(xué)院，山西晉中030619）

黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根［1］。黃芪中含有多種重要的活性成分，其中黃酮類成分具有免疫調(diào)節(jié)、抗損傷、抗突變、抗腫瘤、抑制動脈粥樣硬化等活性［2］。

隨著對黃芪深入研究，它不僅可供藥用，還被開發(fā)為保健品、食品及化妝品等廣泛使用，使得黃芪市場出現(xiàn)了供不應(yīng)求的局面。

黃芪種植地域性廣，但其中山西黃芪的種植方式和生長年限最接近傳統(tǒng)野生資源，商品藥材的性狀幾乎與野生黃芪無區(qū)別，但占用土地年限長，因根深采刨困難，提高了生長成本，故產(chǎn)量有限［3］。黃芪根入藥時，大量地上部分被丟棄或焚燒，造成很大的藥源資源浪費。

山西省渾源縣是黃芪道地產(chǎn)品“正北芪”的原產(chǎn)地，素有“中國黃芪之鄉(xiāng)”“正北芪之鄉(xiāng)”的美譽。

課題組以渾源黃芪地上部分（莖、葉、種、稈）作為研究對象，以地下部分作為對比，對其中黃酮類成分進行定性、定量研究，旨在開發(fā)黃芪藥材新的藥用部位，為渾源黃芪地上部分科學(xué)合理的應(yīng)用提供依據(jù)，進一步擴大黃芪藥用資源的利用價值。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器

Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent Chemstation色譜工作站、VDW 1314B紫外可見檢測器、G1311A四元泵、G1316A柱溫箱，美國安捷倫公司）；B-220型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、XB120A型電子分析天平（上海精密化學(xué)儀器制造廠）、TCQ-250型超聲波清洗機（北京醫(yī)療設(shè)備生產(chǎn)二廠）。

1.2 實驗試劑

芒柄花素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（購于上海永恒生物科技有限公司，批號為20120528、20120428）；芒柄花苷、毛蕊異黃酮對照品（購于成都曼斯特生物科技有限公司，批號為13021808、13021808）；3-羥基-9，10-二甲基紫檀烷、7，2′-二羥基-3′，4′-二甲氧基異黃烷對照品（購于江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司，批號為YJ150718、YJ150717），各對照品質(zhì)量分數(shù)均大于98%。乙腈（美國Fisher公司，色譜純）、純凈水（娃哈哈牌），甲醇等其余試劑均為分析純。

1.3 實驗藥材

本實驗所用藥材由山西省道地藥材——渾源黃芪藥材種植基地提供，經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院白云娥教授鑒定為豆科植物蒙古黃芪的干燥根及地上部分（莖、葉、種、稈）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動相為乙腈（A）-水（B），體積流量 1.0 mL/min，Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），紫外檢測波長 230 nm，柱溫 25 ℃，進樣量 20 μL［4］。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

2.2 配制對照品溶液

本實驗采用多指標定量法對黃芪中6種黃酮類成分進行同時測定，故對照品應(yīng)配制成混合對照品溶液，即該溶液中含有含量已知的6種黃酮類對照品。具體配制方法如下：精密稱取對照品適量置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，由此，可得到6種黃酮化合物各自的對照品儲備液。然后每種儲備液取適量，置于25 mL容量瓶中，甲醇定容，即制得混合對照品溶液（A）。各儲備液濃度及混合對照品溶液中各成分濃度見表2。

表2 混合對照品溶液各成分濃度表

2.3 供試品溶液的制備

劉宗彬等［5］通過單因素實驗考察黃芪黃酮最佳提取工藝條件為：顆粒細度0.075～0.25 mm之間，超聲20 min，料液比達到1∶15，乙醇濃度為80%。

取黃芪藥材，粉碎，過80目篩，備用。精密稱取黃芪地上部分、地下部分粉末各5 g，放入錐形瓶（具塞）中，加15倍量的80%乙醇，超聲20 min，提取2次，合并濾液，濾過，置于水浴鍋上蒸餾濃縮至干，用甲醇將殘渣溶解后定容至10 mL容量瓶中，振搖、混勻，即可。

2.4 標準曲線的制備

以對照品的濃度為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，可得線性回歸方程。

本實驗中作為橫坐標的一系列對照品的濃度是將“對照品溶液的配置”中制備的6種對照品的儲備液按照原溶液濃度的1倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍、1/16倍、1/32倍、1/64倍稀釋，每個對照品制成7種不同濃度的溶液，分別用0.45 μm的濾膜過濾，進樣量20 μL，記錄峰面積的積分值。6種對照品的線性回歸方程結(jié)果見表3。

表3 對照品線性回歸方程及其線性范圍

6種對照品在各自的線性范圍內(nèi)都表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度實驗 取混合對照品溶液（A）10μL，采用2.1項下的色譜條件，連續(xù)進樣，共6次，依據(jù)峰面積積分值分別計算其RSD值。結(jié)果見表4。6種黃酮類成分RSD值都小于2.0%，提示該方法符合實驗要求。混合對照品（A）HPLC色譜圖見圖1。

2.5.2 穩(wěn)定性實驗 依據(jù)“2.3供試品溶液制備方法”制作黃芪地上、地下部分的供試品溶液，每隔2 h進樣檢測，12 h內(nèi)共檢測6次。針對不同成分的峰面積積分值計算其RSD值。結(jié)果見表4。RSD值均小于3.0%，表明各供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性實驗 精密稱取黃芪地上部分藥材樣品6份，每份1 g，按本實驗方法制備成供試品溶液，進行HPLC檢測。結(jié)果見表4。RSD值都低于2.5%，表明該實驗方法具有良好的重復(fù)性。

2.5.4 加樣回收實驗 準備黃芪地上、地下部分藥材樣品6份（要求已知藥材中藥物含量），制成供試品溶液，量取供試品溶液2 mL，將其置于5mL棕色容量瓶中，加入2.2項下制備的對照品儲備液1 mL，再加甲醇定容至滿刻度，振搖，混勻。再進行HPLC檢測，測定各成分的峰面積，進而計算平均加樣回收率。結(jié)果見表4。

圖1 混合對照品（A）HPLC色譜圖

經(jīng)以上方法學(xué)考察，所建立的含量測定條件其精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率等均符合規(guī)定，可用于黃芪中黃酮類化學(xué)成分的含量測定。

2.6 含量測定

將供試品溶液稀釋至適宜濃度并進行HPLC含量檢測，進樣量為20 μL。結(jié)果見表5和圖2。

圖2 黃芪地上、地下部分中黃酮類成分種類與含量的比較

黃芪地上部分與地下部分均含有6種黃酮類成分：7，2′-二羥基-3′，4′-二甲氧基異黃烷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、3-羥基-9，10-二甲氧基紫檀烷。經(jīng)比較可以發(fā)現(xiàn)，黃芪地上部分中毛蕊異黃酮含量為地下部分的4倍，芒柄花苷含量為地下部分的2倍，7，2′-二羥基-3′，4′-二甲氧基異黃烷的含量約為地下部分的1.1倍，芒柄花素和3-羥基-9，10-二甲氧基紫檀烷含量差別不明顯，但地下部分中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量高于地上部分，約為2.5倍。黃芪地下部分總黃酮含量略高于地上部分。

3 討 論

中藥黃芪中有多個有效部位，包括總黃酮、總皂苷、多糖類等，具有多種生物活性，其中黃酮類化合物是黃芪中分離的抗氧化、清除自由基的主要活性成分，具有明顯的抗腫瘤、抗損傷和抗突變的作用［6］。

表4 方法學(xué)考察結(jié)果

本文對山西道地藥材——渾源黃芪地上部分與地下部分中黃酮類化合物進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芪地上部分與地下部分所含黃酮類化合物種類相同，只是在含量上存有差別，除了毛蕊異黃酮葡萄糖苷（B）外，地上部分的芒柄花苷（A）、毛蕊異黃酮（C）、7，2′-二羥基-3′，4′-二甲氧基異黃烷（F）的含量明顯高于地下部分，而芒柄花素（D）和3-羥基-9，10-二甲氧基紫檀烷（E）的含量不低于地下部分，但就總黃酮含量來說，地下部分略高于地上部分。

表5 黃芪地上、地下部分黃酮類成分含量比較

以上結(jié)果為黃芪地上部分可利用價值進一步奠定了理論基礎(chǔ)。一方面，為擴大新藥源奠定了理論基礎(chǔ)，另一方面，如若能將黃芪地上部分充分利用，變廢為寶，還可增加黃芪種植基地的就業(yè)機會、提高企業(yè)經(jīng)濟效益和社會效益。

黃芪為春、秋兩季采摘，地上部分受氣候、季節(jié)影響較大，為充分利用黃芪地上部分，后續(xù)還將研究季節(jié)、氣候?qū)喸袋S芪地上部分化學(xué)成分的影響。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

［2］張薔，高文遠.黃芪中有效成分藥理活性研究進展［J］.中國中藥雜志，2012，37（21）：3 203-3 207.

［3］秦雪梅，李震宇.我國黃芪藥材資源現(xiàn)狀與分析［J］.中國中醫(yī)藥雜志，2013，38（19）：3 234-3 238.

［4］萬燕晴.基于化學(xué)成分的黃芪藥材質(zhì)量評價［D］.太原：山西大學(xué)，2015.

［5］劉宗彬，孫英華.黃芪黃酮的超聲輔助提取工藝研究［J］.白城師范學(xué)院學(xué)報，2015，29（5）：6-8.

［6］張冬青，汪德清.黃芪總黃酮生物活性作用研究進展［J］.中國中藥雜志，2010，35（2）：253-255.