改良的亞油酸—硫氰酸鉀顯色法在抗氧化實驗教學(xué)中的應(yīng)用

劉金釧　袁爾東　嚴(yán)慧玲　任嬌艷

摘 要 通過減少亞油酸加入量并加入氧化促進(jìn)劑，對傳統(tǒng)的亞油酸-硫氰酸鉀顯色法加以改進(jìn)，使基于該法的抗氧化實驗得以在本科實驗教學(xué)中成功實施。該法耗時較少，實驗數(shù)據(jù)合理，重現(xiàn)性良好。

關(guān)鍵詞 亞油酸 硫氰酸鉀 抗氧化實驗 實驗教學(xué)

中圖分類號：G424 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdks.2017.12.059

Application of a Modified Linoleic Acid-KSCN Method on Antioxidation in Experimental Teaching

LIU Jinchuan， YUAN Erdong， YAN Huiling， REN Jiaoyan

（National Institute of Light Industry and Food Experimental Teaching Demonstration Center， School of Food Science and Engineering， South China University of Technology， Guangzhou， Guangdong 510641）

Abstract By reducing the amount of linoleic acid and adding to the traditional oxidation accelerator， linoleic acid potassium thiocyanate colorimetric method is improved， so the method of antioxidation experiment has been successfully implemented in undergraduate experimental teaching based on. This method has less time， reasonable experimental data and good reproducibility.

Keywords linoleic acid； KSCN； antioxidation experiment； experimental teaching

油脂是生物體及其食品的重要組成部分。油脂的氧化酸敗不僅會對食品的風(fēng)味、色澤等產(chǎn)生影響，導(dǎo)致食品品質(zhì)下降和產(chǎn)品貨架期的縮短；另一方面，生物體內(nèi)的脂質(zhì)氧化會對生物膜、酶、蛋白質(zhì)等造成破壞，可能導(dǎo)致衰老和癌變，從而危害機體健康。外源性抗氧化劑可有效延緩油脂及含油食品的氧化變質(zhì)，并有助于維持生物體的氧化還原平衡，因此，抗氧化劑在食品、保健品及藥品中均具有廣泛的應(yīng)用前景。通過實驗教學(xué)闡述抗氧化劑抑制油脂氧化的作用有利于學(xué)生理解掌握油脂的氧化原理及抑制油脂氧化的方法，對于食品專業(yè)的學(xué)生非常有益。

亞油酸-硫氰酸鉀顯色法是應(yīng)用最廣泛的抗氧化性檢測方法之一。然而，由于該法耗時較長，且受樣品的乳化特性影響較大，實驗結(jié)果不穩(wěn)定，目前在食品生物化學(xué)實驗教學(xué)中甚少開展相關(guān)實驗項目。本實驗以大豆蛋白水解液（大豆肽混合液）及二氫楊梅素為抗氧化劑，研究其對亞油酸過氧化的抑制作用，并對經(jīng)典的亞油酸-硫氰酸鉀顯色法進(jìn)行了改良，可有效縮短實驗時間，并減少樣品的乳化特性干擾，具有良好的重復(fù)性，適合在本科實驗教學(xué)中應(yīng)用。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

亞油酸、2， 2-偶氮-二（2-甲基丙基咪）-二鹽酸鹽（AAPH）購于阿拉丁試劑（上海）有限公司；二氫楊梅素樣品為藤茶中提取后經(jīng)六次重結(jié)晶后獲得的自制樣品（純度>95%），用乙醇配成0.5mg/mL溶液備用；其余試劑為國產(chǎn)分析純。所使用的儀器為電熱恒溫水浴鍋和美普達(dá)UV1800型可見光分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆蛋白水解液（大豆肽混合液）的制備

稱取大豆蛋白5.0g，用水配成5%溶液，并用NaOH調(diào)節(jié)pH7.0，加入80mg木瓜蛋白酶（酶活1000U/mg），于60℃水浴酶解2小時，沸水浴加熱5min滅酶，8000r/min離心5min，取上清液備用，即為待測大豆肽混合液。

1.2.2 亞油酸過氧化反應(yīng)體系

取5mL具塞玻璃試管，加入一定量的抗氧化劑溶液，用溶劑補足至400 L，隨后加入2.5%（v/v）亞油酸100 L以及0.05mol/L pH7.0磷酸鹽緩沖溶液3mL，為加速氧化過程，在體系內(nèi)加入0.05mol/L AAPH水溶液40 L或0.025mol/L FeCl2-EDTA溶液100 L，混勻密閉，于60℃恒溫水浴鍋中避光反應(yīng)。反應(yīng)120min后檢測各試管反應(yīng)液中亞油酸的過氧化情況，了解抗氧化劑對亞油酸過氧化的抑制作用。

1.2.3 硫氰酸鹽顯色法檢測亞油酸的氧化情況

取0.15mL上述反應(yīng)液，依次加入0.02mol/L溶解于3.5%HCl中的FeCl2溶液0.45mL、30% KSCN溶液0.3mL、75%乙醇4.5mL，混勻。準(zhǔn)確反應(yīng)5min后，測定500nm波長下的吸光度（以無水乙醇為參比）。吸光度值越低，說明亞油酸的過氧化情況越少。所有結(jié)果均為試驗三次的平均值。

2 實驗結(jié)果

2.1 大豆肽混合液對亞油酸過氧化的抑制作用

圖1反映了大豆肽混合液對亞油酸過氧化的抑制作用，隨著大豆肽混合液的添加量的增加，亞油酸過氧化的程度逐漸降低，顯示大豆肽混合液有明顯的抗氧化作用。

2.2 二氫楊梅素對亞油酸過氧化的抑制作用

圖2反映了二氫楊梅素對亞油酸過氧化的抑制作用，隨著二氫楊梅素的添加量的增加，亞油酸過氧化的程度逐漸降低，顯示二氫楊梅素有明顯的抗氧化作用。

3 討論

由于油脂的氧化是個相對較為緩慢的過程，用傳統(tǒng)的亞油酸-硫氰酸鉀顯色法研究抗氧化劑對亞油酸的抗氧化作用時，通常需要數(shù)天的時間才能得到顯著的效果，因此不適于應(yīng)用于課堂教學(xué)中。加入微量過渡金屬離子或自由基引發(fā)劑AAPH可催化加速油脂的氧化過程，Nagai[1]、余芳[2]、吳建中[3]等均在相關(guān)的研究中應(yīng)用加速劑加速亞油酸的氧化過程。然而，要在短短2個小時內(nèi)僅靠加速劑仍不能獲得滿意的實驗結(jié)果，反應(yīng)液顯色后的吸光值重復(fù)性較差，且無法體現(xiàn)組別間的差異，甚至?xí)霈F(xiàn)與抗氧化劑實際抗氧化能力不符的實驗結(jié)果。吳建中[3]認(rèn)為造成這種現(xiàn)象的原因可能在于反應(yīng)體系中試劑的乳化性質(zhì)對抗氧化性質(zhì)的研究有著明顯的影響。當(dāng)體系中的亞油酸較多時，容易出現(xiàn)油水分離現(xiàn)象，有絮狀油脂析出，乳濁液體系呈現(xiàn)明顯不穩(wěn)定現(xiàn)象。這對體系的局部反應(yīng)速度、取樣的均勻性等均有顯著的影響，有可能導(dǎo)致乳化性好但抗氧化性差的抗氧化劑顯示出較強的抗氧化活性。因此，為降低乳化特性的干擾，我們參照吳建中[3]的方法進(jìn)行實驗設(shè)計并做了進(jìn)一步改進(jìn)：（1）大幅度減少體系中的亞油酸的加入量，為文獻(xiàn)[3]中的50%；（2）為防止體系中產(chǎn)生的過氧化脂質(zhì)太少，影響了檢測方法的靈敏度，在體系中加入微量FeCl2-EDTA或AAPH等加速氧化進(jìn)程。課堂實踐表明，該方法可在常規(guī)實驗學(xué)時內(nèi)產(chǎn)生足夠的過氧化脂質(zhì)，實驗結(jié)果重現(xiàn)性良好，適合于食品相關(guān)專業(yè)學(xué)生在實驗課程中理解油脂的氧化及用亞油酸-硫氰酸鉀顯色法評價各種抗氧化劑的抗氧化能力的方法，預(yù)期效果良好。

參考文獻(xiàn)

[1] T Nagai， M Sakai， R Inoue， et al. Antioxidative activities of some commercially honeys， royal jelly， and propolis[J].Food Chemistry，2001.75（2）：237-240.

[2] 余芳，安辛欣.富硒綠茶中茶多酚及水提物的抗氧化活性研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012.40（8）：298-300.

[3] 吳建中.大豆蛋白的酶法水解及產(chǎn)物抗氧化活性的研究[D].華南理工大學(xué)，2003.endprint