斑蝥酸鈉注射液細菌內毒素檢查法研究

斑蝥酸鈉注射液系貴州金橋藥業有限公司生產的抗腫瘤藥，臨床上廣泛用于原發性肝癌和白細胞低下癥，是國家藥品標準《化學藥品地標升國標第一冊》收載品種，其質量標準中的熱原檢查法為家兔法。目前未見有關該品種的細菌內毒素檢查法報道，本文參照中國藥典2015年版四部通則1143細菌內毒素檢查法[1]及相關文獻[2-8]，對斑蝥酸鈉注射液的細菌內毒素檢查法進行了試驗性研究。實驗表明，該方法靈敏、快速、經濟，操作簡便。

1 儀器設備與試藥試劑

1.1 儀器設備

BET-48型細菌內毒素檢測儀，天津市騰泰科技公司生產，出廠編號：09-42-104；BHC-1300ⅡA2型生物安全柜，蘇州安泰空氣技術有限公司生產，出廠編號：J09080502；ZH-2型自動旋渦混合儀，天津藥典標準儀器廠生產，出廠編號：9249。

1.2 試藥試劑

斑蝥酸鈉注射液（本品），貴州金橋藥業有限公司生產，規格 2 ml：0.1 mg, 批號：141202，141203，141204；鱟試劑（TAL），湛江安度斯生物有限公司，規格：0.1 ml，批號：1412013，靈敏度：0.25 EU/ml，廈門鱟試劑實驗廠有限公司，規格：0.1 ml，批號：141105，靈敏度：0.25 EU/ml；細菌內毒素工作標準品（WSE），湛江安度斯生物有限公司，10支/盒，效價：10 EU/支，批號：1504280；細菌內毒素檢查用水（BET水），廈門鱟試劑實驗廠有限公司，規格：10 ml，批號：141102。

1.3 方法

1.3.1 細菌內毒素限值（L）確定 按中國藥典2015年版四部通則1 143細菌內毒素檢查法和藥品說明書，該品種滴注劑量為1日1次，每次2～10 ml，可知供試品最大劑量為10 ml，根據公式L=K·M-1，其中M=10 ml×0.1 mg/2 ml/60 kg·h(滴注時間按1 h計）≈0.0 083 mg/kg·h；K=5 EU/kg·h，若以500 ml 0.9%氯化鈉注射液或5%～10%葡萄糖注射液稀釋滴注，則限值L=[5-0.5×500/60]/0.0083=100 EU/mg。考慮到其它影響因素，為保證重癥患者、兒童、老人用藥安全，故應嚴格調整限值至理論計算值的1/3以下，故內毒素限值（L）擬定為25 EU·mg-1。

1.3.2 鱟試劑靈敏度的復核 按中國藥典2015年版四部通則1143靈敏度復核項進行，結果見表1。

1.3.3 干擾試驗預試驗 （1）MVD（最大有效稀釋倍數）的計算。依據公式MVD=CL/λ，其中L為本品的細菌內毒素擬定限值25 EU·mg-1，C為本品的標示濃度，即0.1 mg/2 ml=0.05 mg·ml-1，λ為市售鱟試劑最高標示靈敏度0.03 EU/ ml，故MVD=CL/λ=0.05×25/0.03≈41.7（倍），則本品有效釋濃度可設置 為 0.01 mg·ml-1，0.005 mg·ml-1，0.0025 mg·ml-1，0.00125 mg·ml-1。（2）實驗操作。將本品原液（批號：141202，規格 2 ml：0.1 g）用 BET 水分別稀釋為 0.01 mg·ml-1、0.005 mg·ml-1、0.0025 mg·ml-1、0.00125 mg·ml-1系列濃度的供試品溶液（NPC）；另制備同樣系列濃度的含2λ（0.5 EU·ml-1）細菌內毒素濃度的供試品溶液（PPC）。用上述兩批經過復核的鱟試劑（靈敏度0.25 EU·ml-1）分別與兩個系列濃度的溶液發生反應，每一濃度平行設置兩管，并設陽性對照（PC）2管和陰性對照（NC）2管，混勻，密封，置細菌內毒素檢測儀37℃恒溫60 min。

1.3.4 干擾試驗 取3批本品原液和BET水分別將WSE依法稀釋為含內毒素0.5 EU·ml-1、0.25 EU·ml-1、0.125 EU·ml-1、0.0 625 EU·ml-1的溶液，分別用上述兩批經過復核的鱟試劑（靈敏度0.25 EU·ml-1）試驗，每一濃度平行設置4管，并設陰性對照2管，按中國藥典2015年版四部通則1143干擾試驗項進行試驗。

1.3.5 樣品細菌內毒素檢查 依法（中國藥典2015年版四部通則1143）將3批本品（規格：2 ml：0.1 mg）分別用上述兩批經過復核的鱟試劑（靈敏度0.25 EU·ml-1）進行細菌內毒素檢查（樣品稀釋倍數在允許范圍內），按擬定限值（L）25 EU·ml-1作為判斷標準。

2 結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核結果

兩批鱟試劑經復核均符合規定。見表1。

2.2 干擾試驗預試驗結果

根據預試驗結果初步判定：當使用靈敏度為0.25 EU·ml-1的鱟試劑時，本品原液（濃度為0.05 mg·ml-1）無干擾現象發生。見表2。

表1 鱟試劑靈敏度復核結果

表2 干擾試驗預試驗結果

表3 干擾試驗結果

表4 斑蝥酸鈉注射液細菌內毒素檢查結果

2.3 干擾試驗結果

3批本品原液（濃度為0.05 mg·ml-1），用上述兩批經過復核的鱟試劑（靈敏度0.25 EU·ml-1）進行試驗，Es和Et均在0.5λ～2.0λ之間，符合藥典規定，確認本品原液無干擾作用。見表3。

2.4 斑蝥酸鈉注射液細菌內毒素檢查結果

檢查結果見表4。

3 討論

根據干擾試驗預試驗結果初步判定本品原液（濃度為0.05 mg·ml-1）與靈敏度為0.25 EU·ml-1的鱟試劑反應無干擾作用。干擾試驗將3批本品原液，用2個廠家靈敏度為0.25 EU·ml-1的鱟試劑（經復核）進行試驗，結果Es和Et均在0.5λ～2.0λ之間，進一步證實原液無干擾作用。對3批斑蝥酸鈉注射液依法按擬定限值檢驗，結果均符合規定。

結論：斑蝥酸鈉注射液中細菌內毒素的量應小于25 EU·mg-1，可用鱟試劑凝膠法替代家兔熱原法進行細菌內毒素檢查。