Mn-ZnS量子點室溫磷光檢測尿液中硫酸慶大霉素

王 婭,莊布軍，吳伯岳，高衛真,

（1.天津醫科大學第二醫院藥學部，天津300211；2.天津醫科大學藥理學系，天津300070；3.天津醫科大學藥學院，天津300070）

氨基糖苷類抗生素以其抗菌活性高、抗菌譜廣且水溶性好[1]等優點被廣泛應用于臨床。其中硫酸慶大霉素是常用的該類藥物之一，主要用于革蘭陰性菌感染的治療[2]。但其耳毒性和腎毒性[3-4]是制約該藥物臨床使用的重要因素。硫酸慶大霉素的血藥濃度與其毒性密切相關[5]，中毒的谷濃度僅為2 mg/L[6]，其藥代動力學存在較為明顯的個體差異，患者的感染程度、年齡和腎功能狀況等都會改變其血藥濃度[7]。因此，為了保證患者用藥的安全性和有效性，有必要進行治療藥物監測（TDM），為制定個體化給藥方案提供依據[8]。目前液相色譜-質譜聯用法[9]、高效液相色譜法[10-11]是較為常用的檢測硫酸慶大霉素濃度的方法。但這些方法成本較大且操作比較復雜繁瑣[12]。熒光檢測是常用的定量分析方法，具有準確、靈敏及操作簡便等優點，而磷光具有較熒光更長的壽命，可以更有效地避免生物體液的自發熒光等的干擾[13]。量子點是一種半導體納米微晶，因其良好的耐光漂白性、吸收光譜寬、發射光譜窄等[14]優點，被廣泛應用于熒光檢測，Mn摻雜的ZnS量子點具有室溫磷光性質，故本實驗基于硫酸慶大霉素對其磷光的敏化作用建立一種簡便、靈敏且線性范圍廣的檢測硫酸慶大霉素的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑 實驗用水為娃哈哈純凈水，所有化學試劑的純度至少是分析純。所用試劑及其供應源：硫酸慶大霉素（上海晶純生化科技股份有限公司，上海，規格：1 g），硫酸慶大霉素注射液（江蘇康寶制藥有限公司，江蘇，規格：2 mL），無水乙醇（天津市光復科技發展有限公司，天津，規格：500 mL），氫氧化鈉（NaOH，天津市光復科技發展有限公司，天津，規格：500 g），乙酸錳[Mn（Ac）2，天津市光復科技發展有限公司，天津，規格：500 g]，二水合乙酸鋅[Zn（Ac）2·2H2O，上海薩恩化學技術有限公司，上海，規格：500 g]，巰基丙酸（MPA，上海薩恩化學技術有限公司，上海，規格：100 mL），硫化鈉（天津市風船化學試劑科技有限公司，天津，規格：500 g），Tris-HCl緩沖溶液（1×10-2mol/L，pH=7.4，配制：10 mL 0.1 mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液與42.0 mL 0.1 mol/L鹽酸混勻，用HCl調pH至7.4并用水定容至100.0 mL容量瓶，密閉保存于室溫中待用）。

1.1.2 實驗儀器 F-380熒光分光光度計（天津市港東科技股份發展有限公司，天津），JA5003A電子精密天平（上海精天電子儀器有限公司，上海），真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司，上海），X85-2S恒溫磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司，上海）。

1.2 方法

1.2.1 量子點（quantum dots，QDs）的合成 參考已發表的文獻[15-16]，用以指導Mn摻雜ZnS QDs的合成。在100 mL三頸燒瓶中加入50 mL 4×10-2mol/L的MPA，2 mL 1×10-2mol/L 的 Mn(Ac)2和 5 mL 0.10mol/L的Zn(Ac)2水溶液。用1 mol/L的NaOH溶液調節pH=11，室溫磁力攪拌并用氬氣脫氧30 min，之后將新配制的Na2S溶液(5 mL 0.10 mol/L)用注射器加入到三頸燒瓶中。繼續通氬氣20 min，隨后將反應液在50℃中陳化2 h。將所得QDs溶液使用等體積無水乙醇進行沉淀、離心并在室溫下置于真空干燥箱中干燥24 h，制備水溶性良好的Mn摻雜ZnS QDs粉末。最后把干燥的QDs粉末在水中復溶，即得到QDs的水溶液。

1.2.2 硫酸慶大霉素標準溶液和注射液的配制 于電子天平上準確稱量100.00 mg硫酸慶大霉素溶于燒杯中，超聲5 min待完全溶解后定容于100.0 mL的容量瓶中，配制成硫酸慶大霉素初濃度C0=1.0×103mg/L。超聲后靜置，待溶液分散均勻后，用水稀釋，配制為C1=20 mg/L的硫酸慶大霉素儲備溶液備用。用倍比稀釋法將1支2 mL 8萬單位（80 mg）的硫酸慶大霉素注射液依次稀釋，至終濃度C2=20 mg/L備用。

1.2.3 硫酸慶大霉素的檢測 向一系列10 mL比色管中依次加入0.50 mLTris-HCl（pH=7.4，0.01 mol/L）、0.50mLMPA包裹的Mn摻雜ZnSQDs（C=0.20mg/L）、不同濃度的硫酸慶大霉素儲備溶液（使最終濃度 依 次 為 C=0.10，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00 mg/L）、然后用水定容至5.0 mL。于室溫下靜置30 min，以310 nm為激發波長，選擇激發和發射的狹縫寬度分別為10 nm和20 nm，PMT電壓為700 V，測定560～610 nm范圍內的磷光光譜，并做出相對磷光強度與硫酸慶大霉素濃度的標準曲線。

1.2.4 尿樣中硫酸慶大霉素的檢測 尿樣采自于健康志愿者人群，檢測前不做任何處理。向10mL比色管中依次加入 Tris-HCl（0.50mL，pH=7.4，1×10-2mol/L）、MPA 包裹的 Mn摻雜ZnS QDs（0.50 mL，0.20 mg/L）、不同濃度的硫酸慶大霉素溶液、尿液（1×10-2mL），然后用水定容至5.0 mL，室溫靜置30 min，以310 nm為激發波長，選擇激發和發射的狹縫寬度分別為10nm和20 nm，PMT電壓為700 V，測定560～610 nm范圍內的磷光光譜。本實驗平行測定3次，將測到的磷光光譜數據代入已做出的標準曲線中，即可得到尿樣中硫酸慶大霉素的濃度。

1.2.5 硫酸慶大霉素注射液的檢測 與尿樣中硫酸慶大霉素的檢測中其他條件完全相同，將尿液和不同濃度的硫酸慶大霉素替換為對應濃度的硫酸慶大霉素注射液。同樣進行平行測定3次。

2 結果

2.1 影響磷光檢測的因素

2.1.1 緩沖溶液類型對室溫磷光檢測的影響 為了考察緩沖溶液對室溫磷光檢測的影響，本實驗對實驗室常用的PBS、Tris-HCl緩沖溶液中的磷光相對強度進行檢測。由圖1可知，在Tris-HCl緩沖體系中，磷光增敏的程度比較大，靈敏度相對較高。

圖1 緩沖溶液類型對磷光檢測的影響Fig 1 Effect of the type of buffer on the phosphorescence detection

2.1.2 緩沖溶液pH對室溫磷光檢測的影響 在影響QDs強度與穩定性的因素中，溶液的pH最為重要。本實驗考察了在其他條件不變時，反應體系pH值在5.0～9.5范圍內檢測體系的穩定性。由圖2可知，溶液pH在7.0～7.5之間時，磷光強度雖相比于其它pH較低，但QDs的磷光強度具有較好的穩定性。

圖2pH對Mn摻雜ZnS QDs穩定性的影響Fig 2 Effect of pH on the RTP stability of the Mn-doped ZnS QDs

2.1.3 體系反應時間對室溫磷光檢測的影響 考察不同反應時間下，硫酸慶大霉素對體系磷光強度的影響。其他條件不變時，測量反應體系靜置10～50 min內磷光強度的變化，每隔5 min測量1次。由圖3可知，靜置時間在30 min左右時，磷光強度開始變得穩定，且在隨后的20 min內保持穩定。

2.1.4 QDs濃度對室溫磷光檢測的影響 在保證其他條件不變，一定濃度硫酸慶大霉素存在的情況下，我們加入不同濃度的QDs并檢測其磷光強度。低濃度的硫酸慶大霉素會對Mn摻雜ZnS QDs產生磷光增敏。但當Mn摻雜ZnS QDs的濃度過高或者過低時，硫酸慶大霉素引起磷光的增敏都會大大降低（圖4）。當Mn摻雜ZnS QDs的濃度為2×10-2mg/L左右時，其磷光強度增強幅度較大。

圖4QDs濃度對Mn摻雜ZnS QDs相對磷光強度的影響Fig 4 Effect of QDs concentration on the relative phosphorescence intensity of the Mn-doped ZnS QDs

2.1.5 溶液加入順序對室溫磷光檢測的影響 比色管中含有以下成分：Mn摻雜ZnS QDs溶液、硫酸慶大霉素溶液、Tris-HCl緩沖溶液、尿液以及水溶液，分別以3種不同的順序加入到比色管中，靜置30 min后測量磷光強度。結果顯示，加入順序對磷光檢測體系幾乎沒有影響（圖5）。本實驗選擇的順序是先加入Tris-HCl緩沖溶液，再加入Mn摻雜ZnS的QDs溶液、硫酸慶大霉素溶液，尿液，最后用水定容至比色管刻度。

圖5 加入順序對磷光檢測體系的影響Fig 5 Effect of the order of addition on the phosphorescence detection system stability

2.1.6 共存離子對室溫磷光檢測的影響 考察了幾種常見的離子對Mn摻雜ZnS QDs磷光檢測硫酸慶大霉素的影響。當硫酸慶大霉素的濃度為0.20 mg/L 時，500 倍的 Na+、K+，5 倍的 Ca2+、Mg2+對其室溫磷光強度影響均不大（表1）。

2.2 Mn摻雜ZnS QDs對硫酸慶大霉素的磷光響應 在pH=7.4的Tris-HCl緩沖體系中檢測，于室溫下放置30 min。不同濃度硫酸慶大霉素的加入對Mn摻雜ZnS QDs磷光發射光譜的影響如圖6所示。由圖6 A可知，隨著硫酸慶大霉素濃度的增加，Mn摻雜ZnS QDs的磷光峰值顯著升高；由圖6 B可知，校正曲線（y=3.85×10-4x+1.54×10-4）的線性范圍為 0.10～10.00 mg/L，R2=0.998 5。

表1 共存離子的影響Tab 1 Effect of coexisting ions

圖6 不同濃度硫酸慶大霉素對Mn摻雜ZnS QDs磷光光譜（A）和標準曲線（B）的影響Fig6 Influence of the concentration of added gentamicin sulfate on the phosphorescence spectra(A)and on the calibration curve(B)of the Mn-doped ZnS QDs

2.3 Mn摻雜ZnS QDs對硫酸慶大霉素的測定 在熒光分光光度計上選擇激發波長310 nm、發射波長560～610 nm進行磷光掃描，并測定最大發射波長下的磷光強度，再將最大磷光強度代入校正曲線中（y=3.85×10-4x+1.54×10-4）計算尿液中硫酸慶大霉素以及硫酸慶大霉素注射液濃度，結果列于表2。

表2 硫酸慶大霉素測定結果Tab 2 Results for determination of gentamicin sulfate

3 討論

本實驗先對有可能影響QDs在檢測體系中穩定性和磷光強度的因素進行了考察，驗證了緩沖溶液pH及類型、體系反應時間、QDs的濃度及溶液加入順序等條件對檢測體系的影響。該QDs用于檢測硫酸慶大霉素濃度，需要保證其磷光強度和穩定相較好的反應體系，由圖1可知，不同類型的緩沖溶液對Mn摻雜ZnS QDs磷光強度的影響存在差別，本實驗最終選用Tris-HCl作為緩沖溶液。由圖2可知，體系的pH對Mn摻雜ZnS QDs穩定性和磷光強度影響很大，pH過大或者過小QDs的磷光強度均不穩定，而硫酸慶大霉素為酸性溶液，不同濃度的硫酸慶大霉素溶液會使體系的pH產生變化，因此需要加入適當的緩沖溶液維持體系在一個相對穩定的pH環境中。同時，由于硫酸慶大霉素對Mn摻雜ZnS QDs的磷光存在增敏效果，為了獲得更高的靈敏度，應該盡可能降低空白樣品（只含有QDs而不含有被測物）的磷光強度。因此，本實驗選用的反應體系為pH=7.4的Tris-HCl溶液，由圖3可知，QDs在體系中靜置時間較短時，其磷光強度呈不規則變化，這是由于反應時間短，QDs和硫酸慶大霉素的相互作用不充分，反應時間在30～50 min時磷光強度相對穩定，而時間過長，又違背了快速檢測原則，基于此本實驗選擇的體系反應時間為30 min。由圖4可知，QDs濃度過低時，硫酸慶大霉素引起磷光增敏的靈敏度會大大降低；而濃度過高時，隨著藥物濃度的增加，磷光強度會超出磷光測量的最大范圍，同時QDs也會發生自淬滅現象，導致靈敏度也會降低，因此本實驗選擇2×10-2mg/L的Mn摻雜ZnS QDs用于硫酸慶大霉素的室溫磷光檢測。由圖5及表1可知，溶液的加入順序和共存離子對Mn摻雜ZnS QDs的室溫磷光檢測結果影響不大。由圖6A可知，硫酸慶大霉素對Mn摻雜ZnS QDs的磷光強度存在明顯的增敏作用。硫酸慶大霉素的濃度與QDs的磷光強度成良好的線性關系，其線性范圍為 0.10～10.00 mg/L，R2=0.998 5（圖 6B）。基于此建立了一種高靈敏度且簡便的硫酸慶大霉素的檢測方法。慶大霉素在人體內幾乎不被代謝，大多是以原型從尿中排出體外，因此尿液藥物濃度可高達100.0 mg/L[13]。由表2可知，用該方法可以測定尿液中硫酸慶大霉素以及硫酸慶大霉素注射液的濃度。尿樣的采集無創且便捷，如果可以用尿藥濃度間接反映血藥濃度，從而指導患者用藥，將大大降低患者反復取血的痛苦等缺點。至于尿藥濃度是否可反映血藥濃度的變化情況需進一步研究。關于血藥濃度與尿藥濃度對比實驗，是我們下一步將要展開的工作。本文基于硫酸慶大霉素對Mn摻雜ZnS QDs的磷光增敏現象，建立了一種簡便、快速測定尿液硫酸慶大霉素濃度的新方法，該方法有望用于生物體液中硫酸慶大霉素的檢測。

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