磷酸西他列汀片的質量控制

張金芬，周禹宏，李繼彬，邢正英，房志仲

（天津醫科大學藥學院,天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津300070）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一種以慢性高血糖為特征的代謝紊亂性疾病，可累及全身各個系統，誘發嚴重的并發癥，危害人體健康。其中，90%以上為 2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)[1-2]。研究表明，2型糖尿病的發病呈逐漸加重的流行趨勢[3]。傳統的治療2型糖尿病的藥物主要為雙胍類藥物二甲雙胍、磺脲類藥物格列本脲、TZD類藥物羅格列酮、格列奈類藥物瑞格列奈等，其副作用如體質量減輕、低血糖、惡心嘔吐、水腫等限制了其在臨床上的使用[4]。故開發和研究新型抗糖尿病藥物對治療糖尿病具有重要意義。近年來，隨著人類對糖尿病發病機制的深入研究，發現了一些具有降血糖作用的新靶點[5-6]，二肽基肽酶-4(DPP-4)即為其中1種，DPP-4可使具有血糖下調作用的胰升糖素樣肽-1（GLP-1）及糖依賴性胰島素釋放肽（GIP）裂解失活，隨之研發出的DPP-4抑制劑可通過選擇性地抑制DPP-4，減少二者在體內的失活，延長內源性的GLP-1及GIP的活性作用時間，促進胰島B細胞分泌胰島素的同時降低胰高血糖素的濃度，通過雙途徑發揮降血糖的作用。磷酸西他列汀為首個治療2型糖尿病的DPP-4抑制劑[7]，近年來廣泛用于治療2型糖尿病[8]。已有研究表明，磷酸西他列汀治療2型糖尿病效果十分理想[9-10]。作為一種新型抗糖尿病藥物，磷酸西他列汀具有血糖依賴性，降糖作用適中，在增加胰島素分泌的同時不會發生低血糖，有效減輕饑餓感等優勢，且無惡心嘔吐、水腫及增加體質量等副作用[11-14]。本課題對自制的磷酸西他列汀片進行了質量控制方面的研究，摸索高效液相色譜法條件，建立自制制劑中主藥的質量控制方法。同時參照歐洲藥典[15]，建立磷酸西他列汀片溶出度的有效測定方法。

1 材料與方法

1.1 試藥 供試品：磷酸西他列汀片（自制）；參比制劑：磷酸西他列汀片（捷諾維?杭州默沙東制藥有限公司，批號：L030511）；對照品：磷酸西他列汀（武漢遠程共創科技有限公司，批號：20160808）；甲醇（天津康克德科技有限公司，色譜純）；其他試劑均為市售分析純；蒸餾水（自制）。

1.2 儀器 高效液相色譜儀（美國Spectra-Physics）；柱溫箱（Model100，天津市威儀科技發展有限公司）；Anastar色譜工作站（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；RCZ-8A智能溶出儀（北京宏昌信科技有限公司）；電子分析天平（天津博達宏力科技發展有限公司）；80-2B型臺式離心機（蘇州裕宸儀器有限公司）；TS-6A型超聲波清洗器（常州華冠儀器有限公司）；酸度計PHS-25（上海精密科學儀器有限公司）；U-3310分光光度計（天美科技有限公司TECHCOMPLIMITED）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 TIANHE?KromasilC18色譜柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1%HClO4=45∶55；檢測波長 λ=205nm；流速為 0.8mL/min；柱溫為25℃；進樣量20 μL。

1.3.2 溶液制備 （1）對照品溶液的制備：精密稱取磷酸西他列汀對照品12.87 mg至50 mL量瓶中，加入流動相溶解并定容，搖勻即得儲備液；精密量取2 mL上述儲備液置于10 mL量瓶中，流動相稀釋并定容，搖勻即得磷酸西他列汀對照品溶液。（2）供試品溶液的制備：取3片自制樣品研磨均勻，精密稱取99.61 mg至50 mL量瓶中，流動相超聲溶解后定容，搖勻；2 000 r/min離心5 min，上清液采用微孔濾膜過濾，精密移取續濾液2 mL至10 mL量瓶中，流動相稀釋并定容，搖勻，即得供試品溶液。（3）陰性對照品溶液的制備：按照自制制劑處方制備不含磷酸西他列汀的空白制劑，按照上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液。

1.3.3 專屬性試驗 分別吸取“1.3.2”項下配制的對照品溶液及陰性對照品溶液各20 μL進樣，按照“1.3.1項下”的色譜條件進行測定并記錄色譜圖。

1.3.4 線性關系考察 精密稱取磷酸西他列汀對照品64 mg至100 mL量瓶中，適量流動相超聲溶解后稀釋至刻度，搖勻，即得0.64 mg/mL的磷酸西他列汀對照品儲備液；使用移液管精密量取上述對照品儲備液 0.1、0.7、0.9、1.0、1.1、1.3 和 1.5 mL 至 10 mL量瓶中，流動相稀釋至刻度，搖勻，即得6.4、44.8、57.6、64、70.4、83.2 和 96 μg/mL 的對照品溶液。取上述溶液20 μL，按照“1.3.1項下”的色譜條件進行測定并記錄其色譜圖，對其峰面積進行線性回歸。

1.3.5 精密度試驗 （1）重復性試驗：按照“1.3.1項下”供試品溶液的制備方法對同一批樣品進行處理得到樣品溶液，重復進樣6次，按照“1.3.1項下”色譜條件進行測定，計算峰面積的RSD。（2）中間精密度：在不同的檢查日期，采用不同的分析儀器，不同的試驗人員，按照“重復性試驗”方法測定，計算峰面積的RSD。

1.3.6 穩定性試驗 取“1.3.2項下”配制的對照品溶液，分別于第 0、4、8、12、24 h 進樣，按照“1.3.1 項下”色譜條件進行測定，計算峰面積的RSD。

1.3.7 準確度試驗 （1）對照品儲備液的配制：精密稱取磷酸西他列汀對照品64 mg至100 mL量瓶中，適量流動相超聲溶解后定容，搖勻，靜置待用；（2）全輔料儲備液的配制：將輔料（5片量）按照處方比例混合均勻，取285 mg至100 mL量瓶中，流動相超聲溶解后定容，搖勻，離心，取上清液，靜置待用；（3）分別精密量取上述全輔料儲備液1.0 mL，再分別量取上述對照品儲備液0.8、1.0和1.2 mL置10 mL量瓶中，流動相稀釋至刻度，搖勻，即得80%、100%、120%的回收率待測溶液；按照“1.3.1項下”色譜條件進樣，每個濃度平行測定3次，記錄色譜圖，計算主藥的加入濃度與檢驗濃度，并求出回收率。

1.3.8 含量測定 根據“1.3.2項下”供試品溶液的制備方法對自制的3批樣品進行處理得到樣品溶液，進樣，按照“1.3.1項下”色譜條件進行測定，采用外標一點法計算磷酸西他列汀濃度。

1.3.9 溶出度測定

1.3.9.1 溶出介質的配制：蒸餾水煮沸脫氣；0.01mol/L HCl：取0.9 mL濃鹽酸至1 000 mL純水中，攪拌使混合均勻，即得；PBS4.5：精密稱取磷酸二氫鉀7.8g于適量純水中，超聲使其完全溶解后，加純水至1 000mL，攪拌使均勻，即得；PBS 6.8：分別精密稱取磷酸二氫鉀6.804 5 g、氫氧化鈉0.944 g于適量純水中，超聲使其完全溶解后，加純水至1 000 mL，攪拌使均勻，即得。

1.3.9.2 溶出度測定方法及線性關系考察：分別精密稱取磷酸西他列汀12.87 mg至4個100 mL量瓶中，純水、0.01 mol/L HCl、PBS 4.5、PBS 6.8 分別作溶劑，超聲使溶解完全，定容，搖勻，即得對照品儲備液；分別精密量取上述對照品儲備液0.5、0.7、0.9、1.0、1.1、1.3和1.5 mL至10 mL量瓶中，各溶劑稀釋并定容，搖勻，按照紫外分光光度法，于205 nm波長下測定其吸光度，平行測定3次，記錄其吸光度，對其吸光度進行線性回歸。

1.3.9.3 對照品溶液的配制：分別精密量取“1.3.9.2”項下4種對照品儲備液各1 mL至10 mL量瓶中，各溶劑稀釋并定容，搖勻，按照紫外分光光度法，于205 nm波長下測定其吸光度，平行測定3次，記錄其吸光度。

1.3.9.4 參比制劑溶出度測定：取磷酸西他列汀片4片，分別記錄其片重，按照《中國藥典》四部附錄溶出度測定Ⅰ法，采用漿法，50 r/min，溫度：（37±0.5）℃，分別以純水、0.01 mol/L HCl、PBS 4.5、PBS 6.8 各 1 000 mL 為溶出介質，于第 5、10、15、20、30、45和60 min取溶出液10 mL，過濾，取續濾液1 mL至10 mL量瓶中，溶出介質稀釋并定容，按照紫外分光光度法，于205 nm波長下測定其吸光度，平行測定3次，記錄其吸光度值，同時補加等量恒溫介質；按對照品溶液的濃度及吸光度值計算參比制劑各時間點的取樣濃度及累積溶出度，繪制累積溶出度曲線。

1.3.9.5自制制劑溶出度測定：取自制制劑4片，分別記錄其片重，按照《中國藥典》四部附錄溶出度測定Ⅰ法，采用漿法，50 r/min，溫度：（37±0.5）℃，分別以純水、0.01 mol/L HCl、PBS 4.5、PBS 6.8 各 1 000 mL為溶出介質，于第 1、3、5、10、15 和 60 min 取溶出液10 mL，過濾，取續濾液2 mL至10 mL量瓶中，溶出介質稀釋并定容，按照紫外分光光度法，于205 nm波長下測定其吸光度，平行測定3次，記錄其吸光度值，同時補加等量恒溫介質；按對照品溶液的濃度及吸光度值計算自制制劑各時間點的取樣濃度及累積溶出度，繪制累積溶出度曲線，計算自制制劑與參比制劑的累積溶出度相似因子f(2)。

2 結果

2.1 專屬性試驗色譜圖 見圖1。在“1.3.1項下”的色譜條件下，主藥色譜圖不受輔料影響，表明采用該色譜條件進行含量測定時專屬性良好。

圖1 專屬性試驗Fig 1 Specific test

2.2 線性關系考察結果 以磷酸西他列汀的峰面積(A)對濃度(C)作線性回歸的標準曲線，得到線性方程為 A=22968.4427C-3504.03，r=0.999 8，表明磷酸西他列汀濃度在6.4~96 μg/mL的濃度范圍內，其濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.3 精密度試驗結果 磷酸西他列汀重復性試驗的RSD為0.94%（n=6）；中間精密度試驗的RSD為0.77%（n=6），表明精密度良好。

2.4 穩定性試驗結果 磷酸西他列汀穩定性試驗的RSD為0.60%，表明磷酸西他列汀在24 h內穩定性良好。

2.5 回收率試驗結果 如表1所示，自制磷酸西他列汀片中西他列汀的平均回收率為100.74%，RSD為0.46%，符合要求。

表1 磷酸西他列汀的回收率試驗Tab 1 The recovery tests of sitagliptin phosphate

2.6 含量測定結果 3批樣品中磷酸西他列汀的含量測定結果見表2。

表2 磷酸西他列汀的含量測定結果Tab 2 Content determination of sitagliptin phosphate

2.7 溶出度試驗結果

2.7.1 線性考察結果 分別以磷酸西他列汀的吸光度（Abs）對濃度（C）作線性回歸的標準曲線，得到4個線性方程分別為：水，y=42.8286x+0.0340，r=0.9995；HCl，y=37.9714x+0.1086，r=0.999 6；PBS 4.5，y=41.9286x+0.0417，r=0.999 8；PBS 6.8，y=42.3429x+0.0450，r=0.999 9。表明磷酸西他列汀濃度在5~15 μg/mL的濃度范圍內，其濃度與吸光度呈良好的線性關系。

2.7.2 累積溶出度曲線 繪制自制磷酸西他列汀片與參比制劑在4種溶出介質中的溶出曲線，計算累積溶出度，結果見圖2~5。自制制劑與參比制劑的累積溶出度在4種溶出介質中的相似因子f(2)分別為64、87、63、59，均大于 50。表明自制制劑與參比制劑具有相似的溶出行為，自制制劑溶出良好。

圖2 自制磷酸西他列汀片與市售磷酸西他列汀片在水中的溶出曲線Fig 2 The dissolution profile of sitagliptin phosphate tablets and control agents in H2O

圖3 自制磷酸西他列汀片與市售磷酸西他列汀片在0.01 mol/L HCl中的溶出曲線Fig 3 The dissolution profile of sitagliptin phosphate tablets and control agents in 0.01 mol/L HCl

圖3 自制磷酸西他列汀片與市售磷酸西他列汀片在PBS4.5中的溶出曲線Fig 3 The dissolution profile of sitagliptin phosphate tablets and control agents in PBS 4.5

圖4 自制磷酸西他列汀片與市售磷酸西他列汀片在PBS6.8中的溶出曲線Fig 4 The dissolution profile of sitagliptin phosphate tablets and control agents in PBS 6.8

3 討論

3.1 色譜條件的篩選 經查閱歐洲藥典及美國藥典[16]得到磷酸西他列汀含量測定的色譜條件為：流動相乙腈-1.36 g/L磷酸二氫鉀-磷酸緩沖液（磷酸調 pH 為 2.0）（15∶85），流速 1.0 mL/min，柱溫 30 ℃，檢測波長為205 nm。考慮到此流動相其鹽溶液部分pH為2.0過酸，可能會對色譜柱損害，故不予考慮。查閱相關文獻[17]得磷酸西他列汀含量測定的色譜條件為：甲醇-0.1%高氯酸 (32∶68)，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長268 nm。將磷酸西他列汀對照品在上述色譜條件下進行進樣分析，其主峰保留時間約30 min，保留時間過長，多次更改甲醇-0.1%高氯酸比例及流速調整主峰保留時間，考察柱溫對色譜峰的影響，同時將磷酸西他列汀對照品按照紫外分光光度法在200~350 nm波長范圍內進行全波長掃描，確定其最大吸收波長。最終得到磷酸西他列汀含量測定的色譜條件為：流動相甲醇-0.1%高氯酸（45∶55），流速 0.8 mL/min，柱溫為 25 ℃，檢測波長為205 nm。

3.2 供試品溶液的制備方法 試驗中我們調整甲醇-0.1%高氯酸比例制備供試品溶液，按照上述色譜條件于0、4、8、12和24 h進樣，觀察其主峰峰面積變化，考察其穩定性，發現磷酸西他列汀在甲醇-0.1%高氯酸任何比例的溶液中都較穩定，其RSD值均小于2.0%，且進樣分析時色譜峰峰形好。為方便實驗操作，故采用流動相作為磷酸西他列汀稀釋液溶解藥品。

3.3 溶出方法的選擇 經查閱歐洲藥典得磷酸西他列汀片的溶出方法為：轉速50 r/min，溶出介質0.01 mol/L HCl(1 000 mL)，溶出時間30 min。查閱其他相關資料得磷酸西他列汀片的溶出方法為：轉籃法，轉速100 r/min，溶出介質水(900 mL)，溶出時間30 min。為了更好地考察磷酸西他列汀在不同pH條件下的溶出行為，我們采用水、0.01 mol/L HCl、PBS4.5及PBS6.8作為4種溶出介質；考慮到人體胃腸道的生理環境及蠕動速度，擬定轉速為50r/min。最終得到磷酸西他列汀片的溶出方法為：漿法，轉速 50 r/min，溶出介質水、0.01 mol/L HCl、PBS4.5 及PBS6.8（1 000 mL），溶出時間 60 min。

3.4 溶出樣品溶液的配制 為使試驗操作簡便易行，試驗中我們采用紫外分光光度法進行溶出樣品溶液的測定。由于采用紫外分光光度法測定樣品溶液的吸光度時，以樣品溶液的吸光度度數在0.3~0.7之間為宜，試驗中我們通過嘗試確定將溶出樣品溶液的濃度稀釋5倍，使其吸光度度數在0.3~0.7之間。

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